黃連解毒湯“方證對應(yīng)”的PK-PD研究和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的應(yīng)用Δ

邱碧菡，潘林梅，朱華旭，郭立瑋（南京中醫(yī)藥大學中藥復(fù)方分離工程重點實驗室，南京市 210029）

“方證對應(yīng)”是中醫(yī)辨證論治中的一個重要概念，首見于東漢張仲景《傷寒論》：“病皆與方相應(yīng)者，乃服之”，通常指方藥與病證之間存在著對應(yīng)關(guān)系。方藥與病證通過對應(yīng)關(guān)系所形成的證治系統(tǒng)是中醫(yī)藥學經(jīng)驗和理論的重要基礎(chǔ)。從“方證對應(yīng)”入手，深入研究某一方與某一證的特定對應(yīng)關(guān)系，可以明確地認識或揭示該證的病變實質(zhì)，闡明該方治療該證的功效實質(zhì)，可按“方證對應(yīng)”規(guī)律將證候、病機、治法、組方、療效評價等融為一體，形成一種特定的“方證對應(yīng)”綜合體系[1]。筆者試圖結(jié)合近年來清熱解毒代表方——黃連解毒湯的藥動-藥效學（PK-PD）研究成果及本課題組的前期工作基礎(chǔ)和個人見解，探討基于“方證對應(yīng)”的黃連解毒湯研究的可行方向。

1 “方證對應(yīng)”理論的現(xiàn)代認識

“方證對應(yīng)”中的“方”是指具有特定藥味、藥量、劑型、用法等內(nèi)容的藥用形式，“證”則是指特定方劑所針對的具體病證，“方證對應(yīng)”是指一首方劑內(nèi)的藥味及其配伍關(guān)系與其針對的病證病機之間具有高度的對應(yīng)性。“方證對應(yīng)”強調(diào)了方藥與病證之間的內(nèi)在關(guān)系，即方劑的功用是特定方藥與特定病證之間相互作用的結(jié)果，方藥與機體的密切關(guān)聯(lián)是中醫(yī)辨證論治中的重要特征[2]?，F(xiàn)代研究對這一理論有了進一步的認識，主要有如下幾個方面。

1.1 方證對應(yīng)必須是方劑與主證相對應(yīng)

方劑功效是方藥作用于特定病證而顯示出來的，表現(xiàn)為方劑功效對證具有依賴性或選擇性[3]。針對特定病證組成的方劑，一旦離開其所針對的病證，方劑便不再具有意義。此即為方劑的“有證而為，無證而不為”[4]。只有對證治療時，方藥才能顯示治療作用；若方不對證或機體處于非證候狀態(tài)時，則幾乎無治療作用甚或產(chǎn)生不良反應(yīng)。

1.2 方證對應(yīng)是指證不變方亦不變，方隨證變，隨證加減[2]

如果臨床當前病證與原方主治病證病機相同時，則直接選用成方，所謂“有是證用是方”；如果當前病證與原方主治病證病機有一定差異，則須對所選方劑進行適當加減，以使加減后的方藥能與當前的病證病機高度對應(yīng)，此即所謂的“方隨證變，隨證加減”。

1.3 方證對應(yīng)是方證間病勢、病位、病情、病性相對應(yīng)[5]

證包含4個基本要素，即病變部位（定位）、病勢緩急（定勢）、病情盛衰程度（定量）和疾病性質(zhì)或?qū)傩裕ǘㄐ裕环絼┮舶?個基本要素，即方藥作用部位（定位）、方藥作用緩峻（定勢）、方藥作用強度（定量）以及方藥作用性質(zhì)或?qū)傩裕ǘㄐ裕?。因此，方證對應(yīng)關(guān)系應(yīng)遵循定位、定勢、定量、定性同步的原則。

1.4 方證對應(yīng)是一個動態(tài)對應(yīng)[6]

方作用于其對應(yīng)的證之后，證隨之發(fā)生變化，此時方與證就產(chǎn)生一定差距，由對應(yīng)到不對應(yīng)或到對應(yīng)程度較差，此時須密切觀察病情變化，及時調(diào)整和縮短方證之間的誤差和距離，使之重新達到對應(yīng)狀態(tài)。因此方證對應(yīng)的動態(tài)性，要求在辨證論治原則指導下，隨著病情的演變，適時地對方劑藥味、藥量、劑型進行靈活變化；若已轉(zhuǎn)為他證者，則需另擇他方。

1.5 方證對應(yīng)可以是一方對多證、一證對多方[2]

方證對應(yīng)不僅指一方一證相互對應(yīng)，也包括一方與多證相互對應(yīng)、一證與多方相互對應(yīng)，即所謂“同方異證”、“同證異方”。一味藥含有多種成分，由多味藥組成的復(fù)方所含成分則更為復(fù)雜，而人體也是一個多維復(fù)雜系統(tǒng)，當復(fù)雜方藥系統(tǒng)作用于復(fù)雜人體病證系統(tǒng)時，則可能呈現(xiàn)出多方面的效應(yīng)。

2 黃連解毒湯“方證對應(yīng)”的PK-PD研究

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，為清熱解毒代表方，主要含生物堿（小檗堿、巴馬汀等）、黃酮（黃芩苷、漢黃芩苷等）、環(huán)烯醚萜苷（梔子苷）三大類成分，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證，適用于多種急性熱毒病。近年來，黃連解毒湯的藥效學研究不斷取得新的進展，許多文獻報道該方具有良好的改善腦缺血、缺氧等作用，在用于治療腦血管疾病方面具有可觀的前景。臨床研究亦表明以黃連解毒湯為代表的清熱解毒中藥在用于治療腦血管疾病方面具有獨到的優(yōu)勢。

2.1 藥動學研究

藥物在生物體內(nèi)的代謝過程研究近年來已成為學術(shù)界關(guān)注的熱點，緣于中藥復(fù)方所含成分的復(fù)雜性，此方面的研究尚處于方法學探索階段[7]。對黃連解毒湯的藥動學研究主要局限于考察正常個體的動力學特征，而病理狀態(tài)下的藥動學研究很少。從相關(guān)的文獻報道[8，9]可知，藥物的體內(nèi)過程可能會受到病理狀態(tài)的影響，對于臨床應(yīng)用而言，病理狀態(tài)下獲得的藥動學參數(shù)甚至更有意義，故研究病理狀態(tài)下藥動學參數(shù)的改變是十分必要的。由于大鼠腦缺血模型能夠較好地模擬人體腦缺血疾病，故在藥動學實驗研究中常被采用。

曾明飛等[10]比較研究了黃連解毒湯中梔子苷在正常及腦缺血大鼠體內(nèi)的藥動學過程。正常大鼠及電凝法制備的腦缺血模型大鼠ig黃連解毒湯后不同時間采血，用高效液相色譜法測定梔子苷的血藥濃度，3p87軟件擬合藥動學參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷在腦缺血及正常狀態(tài)下體內(nèi)藥動學參數(shù)存在明顯差異，AUC（0～∞）分別為（15.819±5.228）、（11.395±3.111）μg·h·mL-1，t1/2分別為（4.704±1.850）、（3.695±1.595）h，Cmax分別為（2.135±0.202）、（1.677±0.621）μg·mL-1。數(shù)據(jù)表明梔子苷在腦缺血狀態(tài)下的血藥濃度及吸收效果優(yōu)于正常狀態(tài)，在體內(nèi)停留的時間較長、消除較慢。Zeng MF等[11]還以類似方法考察了黃連解毒湯中的有效成分黃芩苷在正常及腦缺血大鼠體內(nèi)的藥動學差異。數(shù)據(jù)表明黃芩苷在腦缺血狀態(tài)下Cmax、AUC（0～∞）明顯增加，體內(nèi)生物利用度也有提高。這些研究提示藥動學參數(shù)的變化可能與“證”的存在相關(guān)。

2.2 藥效學研究

黃連解毒湯既能改善腦血液循環(huán)障礙時血液和氧的供應(yīng)，又能抑制腦內(nèi)氧的代謝，可以抵抗雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎、NaNO2、KCN、常壓密閉等物理化學因素導致的小鼠急性腦缺血、缺氧損傷，增加存活率[12，13]。黃連解毒湯的有效部位可明顯減輕大腦中動脈阻塞大鼠神經(jīng)癥狀，減少腦梗死范圍，顯著降低雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠血腦屏障毛細血管通透性及腦組織伊文思藍含量；可以延長雙側(cè)頸總動脈反復(fù)缺血-再灌注大鼠的斷頭張口喘氣時間，降低腦指數(shù)，減輕腦水腫[14，15]。黃連解毒湯提取物能顯著降低腦缺血小鼠大腦皮質(zhì)及海馬組織丙二醛（MAD）和過氧化脂（LPO）含量；顯著增加腦中谷胱甘肽（GSH）的含量；提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）的活力，從而起到很強的抗氧化作用[16，17]。日本岡山大學的KondoY等研究發(fā)現(xiàn)給予腦缺血-再灌注損傷的C57BL/6小鼠口飼黃連解毒湯，可以顯著抑制小鼠海馬CA3區(qū)域錐體細胞神經(jīng)元的壞死，并且促進腦缺血組小鼠海馬星形細胞中Cu/Zn-SOD的表達，從而保護短暫性腦缺血所致氧化應(yīng)激的海馬神經(jīng)[18]。黃連解毒湯不同劑量的有效部位可以降低乳酸脫氫酶（LDH）的漏出率，減少MDA和NO生成，提高SOD活性，從而減少谷氨酸興奮毒性損傷或者保護缺糖/缺氧損傷的大鼠皮層神經(jīng)細胞[19，20]。

3 PK-PD模型

PK-PD模型于1979年由Sheiner等提出。近年來有學者認為，對復(fù)方藥動學分析測定吸收入動物體內(nèi)的活性成分應(yīng)該與藥理效應(yīng)結(jié)合起來，進行量-效關(guān)系的評價，或許會事半功倍[21]。王廣基教授提出了PK-PD結(jié)合研究各效應(yīng)物質(zhì)整體貢獻度的思路：一邊是藥動學研究，多效應(yīng)物質(zhì)定量分析確定各藥效成分藥動學，可以得到多組分藥-時曲線；另一邊是藥效學研究，采用代謝組效應(yīng)法確定效應(yīng)成分的藥效動力學，可得到其標準化時-量曲線；最后進行PK-PD多元相關(guān)分析，獲得各效應(yīng)物質(zhì)對整體藥效的貢獻。進行PK-PD結(jié)合研究的另一優(yōu)勢是方便預(yù)測及控制給藥后效應(yīng)，以指導臨床用藥。PK-PD結(jié)合模型實際上是代表藥效與體內(nèi)藥物濃度量的關(guān)系，通過控制藥物在體內(nèi)的量而控制藥物作用于生物體的效應(yīng)。記錄藥動學參數(shù)及藥效學參數(shù)，對藥物和體內(nèi)結(jié)合部位的結(jié)合性作出定量描述，兩種動力學模型結(jié)合研究，建立時間-濃度-效應(yīng)三維關(guān)系，將能直接預(yù)報給藥后效應(yīng)在時間過程中強度及持續(xù)時間的動態(tài)變化。

目前還沒有關(guān)于黃連解毒湯PK-PD結(jié)合研究的報道，緣于PK-PD模型尚未建立，但王廣基教授的思路或許可以指導黃連解毒湯全方的PK-PD結(jié)合研究：藥動學方面以小檗堿、黃芩苷、梔子苷等主要成分為對象，考察它們在不同機體狀態(tài)下的藥動學參數(shù)；藥效學方面已知黃連解毒湯對腦血管疾病有治療作用，根據(jù)腦血管疾病的發(fā)病機制考察如下指標：神經(jīng)行為學評分、腦梗死率、腦含水量與腦指數(shù)、腦組織中白細胞介素（IL）-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α的含量、腦組織中谷氨酸的含量、尿中兒茶酚胺含量；采集藥動學、藥效學數(shù)據(jù)，建立時間-濃度-效應(yīng)三維模擬關(guān)系。已有文獻報道有學者利用PK-PD結(jié)合模型進行其他中藥復(fù)方的研究，如王秋娟等[22]采用PK-PD結(jié)合模型綜合分析關(guān)附甲素的濃度-時間-效應(yīng)三者之間的關(guān)系，值得借鑒。

4 數(shù)據(jù)挖掘

數(shù)據(jù)挖掘是一種新興的信息處理技術(shù)，它融匯了人工智能、模式識別、模糊數(shù)學、數(shù)據(jù)庫、數(shù)理統(tǒng)計等多種技術(shù)方法，專門用于海量數(shù)據(jù)的處理[23]。黃連解毒湯是一個多成分復(fù)雜體系，體現(xiàn)多模型、多靶點霰彈效應(yīng)，除了生物堿、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等主要成分外，還含有其他數(shù)以百計的微量化合物。這些化合物雖然量少，但作為伴生物質(zhì)對小檗堿等主要成分起協(xié)同或拮抗作用。Rainer HM[24]指出，植物提取物可分為基本活性物質(zhì)和伴生物質(zhì)，伴生物質(zhì)可改變基本活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，從而影響其生物藥劑學參數(shù)，特別是活性物質(zhì)從藥物處方或植物提取物中的溶出和進一步吸收。近年來，我們在開展“基于工業(yè)化分離技術(shù)的黃連解毒湯組合篩選”研究時發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象：在給予相同劑量鹽酸小檗堿的情況下，全方鹽酸小檗堿的AUC明顯大于其他拆方組合組，從而從藥動學的角度揭示了該方組方的科學性。在此基礎(chǔ)上，我們開展了“黃連解毒湯指標成分與PC12細胞的保護率相關(guān)性的數(shù)據(jù)挖掘和知識發(fā)現(xiàn)”試探性研究，用數(shù)據(jù)挖掘方法處理有關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PC12細胞作為黃連解毒湯治療老年癡呆癥的“多靶點作用機制”的靶細胞之一，僅過氧化氫等3種造模即對鹽酸小檗堿等3種指標成分的濃度具有不同的反應(yīng)，充分表現(xiàn)出“藥效作用”與“化學組成”之間的復(fù)雜關(guān)系。那么在更多靶細胞的研究環(huán)境下，“藥效作用”與“化學組成”之間的關(guān)系該如何描述與表達呢？可見其中蘊藏有非常豐富的生物醫(yī)學信息，形成非線性復(fù)雜適應(yīng)系統(tǒng)。這使我們深刻認識到引入數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，進行“數(shù)據(jù)庫中知識發(fā)現(xiàn)”（KDD）研究，從所建數(shù)據(jù)庫中“挖掘”出隱含的規(guī)律，闡明藥效關(guān)系及作用機制在中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究和藥動學研究中的重要性。

正如王永炎院士所言：在已知的藥味組成和臨床有效的結(jié)果面前，認識復(fù)方的復(fù)雜系統(tǒng)，揭示中間的作用過程正是我們的研究目的。而所有復(fù)雜的適應(yīng)性系統(tǒng)，都能建立讓自己預(yù)測世界的模型[25]。要建立預(yù)測模型，首先必須積累一定量的相關(guān)數(shù)據(jù)。賀福元[26]在羅杰英教授指導下，選擇補陽還五湯作為試驗對象，進行中藥復(fù)方藥動學數(shù)據(jù)挖掘及建模工作，提出總量統(tǒng)計矩模型，為黃連解毒湯復(fù)方藥動學數(shù)據(jù)挖掘及預(yù)測模型的建立提供了可借鑒的方法。我們認為可以先選取小檗堿、黃芩苷、梔子苷等主要藥效成分作為指標，積累其在動物體內(nèi)血藥濃度、組織分布等藥動學參數(shù)，腦梗死率、腦含水量、腦指數(shù)等藥效學特征量，聯(lián)系時間變化，建立三維模型，挖掘其中的內(nèi)在關(guān)聯(lián)及潛在規(guī)律，建立預(yù)測模型。

5 思考與展望

黃連解毒湯具體有哪些成分吸收入體內(nèi)?各成分之間如何發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用？機制是什么？效應(yīng)與成分的關(guān)系如何？這些問題都是不容易解決的。不僅是黃連解毒湯，所有中藥復(fù)方目前最大的問題就是在知道其有效的前提下如何用現(xiàn)代西藥學知識解答它。藥動學研究則為黃連解毒湯的發(fā)展和創(chuàng)新提供了有力手段。以方證對應(yīng)理論為指導，用PK-PD方法結(jié)合新理論模式識別、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量機法等新技術(shù)，進行挖掘，構(gòu)建數(shù)學預(yù)測模型。如果能夠建立這樣的預(yù)測模型，掌握方劑與機體之間肯定存在的相互作用及藥動學和藥效學規(guī)律，黃連解毒湯的變化就可預(yù)知[27]。

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