活血益智片對血管性癡呆大鼠海馬區(qū)環(huán)氧化酶-2、核因子-κB表達的影響

齊 越， 金 戈， 賈 冬， 劉 暢， 盛亮亮

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是發(fā)生在腦血管病基礎(chǔ)上的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主的智能持續(xù)性損害，是居于第2位的最常見癡呆［1］，發(fā)病原因主要與反復(fù)性腦缺血再灌注有關(guān)［2］，而隨后促發(fā)的炎性反應(yīng)則是導(dǎo)致腦缺血性損傷的重要因素。環(huán)氧化酶2(COX-2)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通過自由基、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等多種途徑參與腦缺血后炎癥反應(yīng)，引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙?；钛嬷瞧怯墒牌选ⅫS芪、當(dāng)歸、山楂、丹參等組成，諸藥合用可具有益氣活血，寧神益智的功效。本實驗采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈同時腹腔注射硝普鈉制造擬血管性癡呆大鼠模型，觀察活血益智片對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并對海馬COX-2、NF-κB蛋白表達進行檢測，旨在探討活血益智片治療血管性癡呆的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料 健康成年SPF級雄性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)60只，體重(250 ±30)g;活血益智片，1．15g生藥/片，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實驗中心提供，批號:091210;甲磺酸二氫麥角毒堿片，1mg×30，西安萬隆制藥有限責(zé)任公司制造，批號:080301;硝普納粉針劑，每瓶50mg，北京雙鶴藥業(yè)有限公司制造，批號:081202;兔抗大鼠COX-2多克隆抗體，小鼠抗大鼠NF-κB多克隆抗體，山羊抗兔IgG抗體，山羊抗小鼠IgG抗體(Santa Cruz);Morris水迷宮(成都泰盟公司);Y迷宮(自制);Western blot電泳儀(BIO-RAD公司，美國)。

1．2 方法

1．2．1 模型制備 參考文獻［3］，腹腔注射水合氯醛350mg/kg麻醉后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，75%酒精消毒頸前皮膚，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈(分離迷走神經(jīng))，腹腔注射硝普鈉2．5 mg/kg，立即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10min，松開動脈夾，再通10min，再夾閉10min，再通后，依次縫合頸部肌肉和皮膚，涂上青霉素，放回籠中保溫飼養(yǎng)，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈。所有大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，可自由得到食物和水。全部造模過程中用肛表密切觀察動物肛溫，保持動物肛溫在(37．0±0．5)℃左右。術(shù)后每只大鼠肌注青霉素0．2萬U，連續(xù)3d。

1．2．2 動物分組及處理 術(shù)后第7天，60只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、活血益智片低劑量(1．55 g/kg)組、中劑量(3．1g/kg)組、高劑量(6．2g/kg)組、甲磺酸二氫麥角毒堿片(5．4mg/kg)組，每組10只。分組后第2天灌胃給藥，給藥容積10ml/kg，每日1次，假手術(shù)組及模型組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥 28d。

1．2．3 行為學(xué)觀察-Y迷宮 實驗裝置由3個夾角為 120°的木制支臂組成，每臂長 40cm，高12cm，上寬10cm，下寬5cm。實驗時將大鼠放入1個臂的末端，讓其自由出入3個臂，記錄8min內(nèi)每只大鼠進入3個臂的總次數(shù)(N)及順序，以連續(xù)進入3個不同的臂為1次正確交替反應(yīng)，記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)。自發(fā)交替反應(yīng)率(%)=［正確交替反應(yīng)次數(shù)/(N-2)］×100%。比較各組大鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率，以評價其空間工作記憶能力。

1．2．4 行為學(xué)觀察-Morriss水迷宮 水迷宮水溫23℃ ～25℃，水中加入牛奶，在固定象限設(shè)有安全臺，液面高于安全臺2cm，各組大鼠進行定位航行實驗，連續(xù)5d，測定其逃避潛伏時間，第5天結(jié)束后，除去安全臺，進行空間探索實驗，測定其在固定象限的游泳時間及穿越安全臺的次數(shù)。各組大鼠進行組間比較，評價其學(xué)習(xí)記憶能力。

1．2．5 Western blot印跡法檢測海馬 COX-2、NF-κB表達 冰上快速分離海馬組織，按10ml/g的比例加入全細胞裂解液，組織經(jīng)勻漿、超聲破碎后，BCA法進行蛋白定量，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。雜交步驟如下:5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2h，4℃下與 COX-2、NF-κB 一抗(1∶500)雜交反應(yīng)過夜后，PBS漂洗PVDF膜3次，每次10min。再將PVDF膜分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶3000)、山羊抗兔二抗(1∶5000)雜交反應(yīng)2h。最后用 Tris-Nacl漂洗 PVDF膜3次，每次10min，加入ECL試劑反應(yīng)5min，保鮮膜包裹，暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張PVDF膜再與 β-actin(1∶1000)進行雜交反應(yīng)。Western blot印跡條帶經(jīng)Gel-oc凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理。

2 結(jié)果

2．1 大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果

2．1．1 Y迷宮 與假手術(shù)組相比，模型組的自發(fā)交替反應(yīng)率降低(P＜0．05);與模型組相比，活血益智片中、高劑量組可明顯增加其自發(fā)交替反應(yīng)率(P＜0．05);提示活血益智片具有改善血管性癡呆大鼠空間工作記憶能力的作用(見圖1)。

2．1．2 Morris水迷宮 各組大鼠術(shù)前篩查的平均逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)，數(shù)據(jù)未顯示。術(shù)后進行定位航行的成績比較:與模型組相比，其它組大鼠學(xué)習(xí)和記憶逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0．05;P＜0．01)?？臻g探索實驗結(jié)果比較:與模型組相比，其它組大鼠的固定象限游泳時間及穿越平臺次數(shù)明顯增加(P＜0．05)。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠行為模式發(fā)生了改變，藥物治療組大鼠行為模式接近假手術(shù)組(見圖2、3、4)。

2．2 COX-2、NF-κB檢測結(jié)果與分析 Western blot印跡法結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型鼠腦海馬組織內(nèi)COX-2、NF-κB水平顯著增高，經(jīng)過活血益智片治療后，COX-2、NF-κB水平顯著降低(見圖5)。

圖1 活血益智片對血管性癡呆大鼠自發(fā)交替反應(yīng)率的影響

圖2 活血益智片對血管性癡呆大鼠逃避潛伏期的影響

圖3 活血益智片對血管性癡呆大鼠固定象限游泳時間的影響

圖4 活血益智片對血管性癡呆大鼠穿臺次數(shù)的影響

圖5 Western blot印跡法檢測海馬區(qū)COX-2及NF-κB表達

3 討論

慢性腦缺血再灌注與VD的病程進展有關(guān)［4］，此種動物模型可以較好地模擬人類VD的腦血流量降低及認(rèn)知功能障礙［5，6］。VD的主要臨床表現(xiàn)為智能的降低，而學(xué)習(xí)記憶則是智能的最基本要素，且較易于測定分析，故往往把學(xué)習(xí)記憶的改善作為智能提高的一個主要指標(biāo)。本實驗采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈同時腹腔注射硝普鈉方法建立慢性腦低灌注狀態(tài)，Y迷宮和Morris水迷宮實驗進行行為學(xué)檢查，表現(xiàn)為模型組大鼠明顯的記憶和學(xué)習(xí)障礙，認(rèn)知功能顯著下降，表明慢性低灌注狀態(tài)對學(xué)習(xí)記憶功能是有影響的。本研究通過對VD大鼠的行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)活血益智片可改善VD大鼠的記憶、學(xué)習(xí)和行為功能，表現(xiàn)為提高大鼠的自發(fā)交替反應(yīng)率、縮短逃避潛伏期、增加固定象限游泳時間及穿越平臺次數(shù)，具有腦保護作用。

海馬是哺乳類動物學(xué)習(xí)和記憶的重要結(jié)構(gòu)區(qū)。慢性腦缺血主要損傷海馬，海馬區(qū)錐體細胞可出現(xiàn)明顯的變性、死亡、甚至丟失，可能是學(xué)習(xí)記憶障礙的主要原因，因此我們選用海馬為研究對象。慢性腦缺血時，腦內(nèi)的免疫細胞可釋放大量的毒性介質(zhì)，例如促炎癥因子、活性氧、NO及谷氨酸鹽［7］。這些物質(zhì)將損害神經(jīng)細胞，破壞血腦屏障(BBB)，反過來，破壞的血腦屏障會進一步加重缺血腦區(qū)的損害［8］。此外，外周白細胞的聚集也可導(dǎo)致微循環(huán)障礙，進一步加重缺血腦區(qū)的損害［9］，事實上，大量實驗研究證實抑制炎癥的級聯(lián)反應(yīng)可對缺血腦區(qū)進行保護［10］。核轉(zhuǎn)錄因子則是缺血后功能障礙炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)［11］。

NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，可參與多種促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，在急性炎癥反應(yīng)中起重要的作用。關(guān)于炎癥反應(yīng)中NF-κB激活的研究多數(shù)在體外細胞培養(yǎng)實驗中進行［12］。最近的動物實驗研究也提示NF-κB參與了腦缺血后的炎癥反應(yīng)及后續(xù)的神經(jīng)炎反應(yīng)［13］。在人類皮層梗死［14］的病理過程中，可見 NF-κB的活性增強，且NF-κB活性的增加與COX-2基因表達增加相關(guān)聯(lián)［15］。大鼠局灶性缺血模型中［16］，NF-κB的活性在缺血后第4天和第7天明顯增加。這些數(shù)據(jù)都支持NF-κB激活與人類的大腦炎癥失調(diào)有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn):假手術(shù)組未見明顯NF-κB表達，而模型組 NF-κB表達顯著增高，這與前人研究結(jié)果類似?；钛嬷瞧山档蚇F-κB的表達，它可能通過:(1)蛋白與蛋白之間的相互作用，捕獲 NF-κB;(2)阻礙 NF-κB 的核轉(zhuǎn)錄;(3)抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性;(4)增強 IκB(NF-κB 的特異性抑制劑)的表達。

在人類和嚙齒類動物的大腦中，COX-2主要存在于神經(jīng)元內(nèi)，為一種誘導(dǎo)酶，于1989年被Simmons等發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下正常組織中無表達或弱表達，缺血刺激會使之表達上調(diào)［17］。大腦的局部及全腦缺血后，COX-2選擇性抑制劑(NS-398)可減少神經(jīng)元內(nèi)COX-2的表達［18］及其腦損傷后所產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子的表達。大量的腦缺血后的研究表明，神經(jīng)元內(nèi)的COX-2水平可通過氧自由基的產(chǎn)生促使神經(jīng)元死亡，同時也伴隨著COX-2 mRNA的上調(diào)。本實驗結(jié)果表明，假手術(shù)組COX-2表達較弱，而模型組的 COX-2表達顯著升高，活血益智片可降低COX-2的表達。人啟動子區(qū)域含有2個NF-κB結(jié)合位點，該位點序列發(fā)生定向突變后，幾乎完全封閉TNF-α 對 COX-2 基因的誘導(dǎo)［19］，可見 NF-κB 位點為COX-2轉(zhuǎn)錄激活所必需。本實驗的結(jié)果表明，模型組的NF-κB及 COX-2表達均增加，顯示 NF-κB與COX-2表達相互促進，這與Lim等［20］的結(jié)果相符合。

綜上所述，作者認(rèn)為大鼠慢性腦缺血再灌注可刺激海馬區(qū)的錐體細胞出現(xiàn)變性、死亡、甚至丟失，隨后促使腦內(nèi)免疫細胞釋放炎癥因子，活化NF-κB進入細胞核內(nèi)，與COX-2啟動子區(qū)域的NF-κB結(jié)合位點結(jié)合，促進COX-2基因的轉(zhuǎn)錄表達，活血益智片通過抑制NF-κB及COX-2表達，進而改善VD大鼠的認(rèn)知能力障礙，產(chǎn)生腦保護作用。

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