維甲酸致神經(jīng)管發(fā)育缺陷中相關(guān)基因的功能分類

李新軍， 韓楊云， 徐 宏， 楊 忠， 曾 義， 孫中書， 李紅麗， 龍曉東， 游 潮

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTD)作為神經(jīng)管異常發(fā)育的一個(gè)病理學(xué)結(jié)果，神經(jīng)管形成時(shí)期極容易受到多種內(nèi)、外因素的干擾，眾多遺傳或環(huán)境因素的改變均可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形，但迄今對(duì)涉及此過程的基因表達(dá)與調(diào)控的研究較少［1］?；蛐酒芡瑫r(shí)監(jiān)控組織細(xì)胞成千上萬基因的表達(dá)，為在分子水平研究復(fù)雜的病理生理過程或信號(hào)通路提供了最有力的工具［2］。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含有1100余個(gè)已知基因的中密度芯片比較了胚胎9．5d、10．5d正常與同期NTD小鼠神經(jīng)管組織的基因表達(dá)差異，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類。以求發(fā)現(xiàn)與NTD發(fā)生和神經(jīng)胚的關(guān)鍵基因，并探討它們可能的分子調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年昆明種小鼠120只，55～65日齡，體質(zhì)量22～28g，無特異病原體，雌雄各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)2007003。

1．1．2 儀器 硅化玻片、雜交密封艙購(gòu)自美國(guó)TeleChem公司;Microcon YM－30為 Millipore產(chǎn)品。ScanArray4000芯片掃描儀為美國(guó)General Scanning公司產(chǎn)品。雜交爐購(gòu)自美國(guó)Robbins Scientific公司。

1．1．3 主要試劑 TRIZOL試劑(RNA提取液)購(gòu)自 Gibco－BRL公司;維甲酸(RA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;基因微點(diǎn)陣購(gòu)自香港Amersham Pharmacia公司;基因序列購(gòu)自美國(guó)Incyte公司小鼠基因文庫(kù)。

1．2 方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 60對(duì)成年昆明種小鼠，于18:00按雌雄1∶1合籠，次日8:00取出，檢查雌鼠陰道口有無陰栓。將發(fā)現(xiàn)陰栓者的當(dāng)日早晨8:00定為孕期第0天(E0d)，16:00定為E0．5d。60只孕鼠被隨機(jī)分成RA組(n=30)和正常對(duì)照組(n=30)。根據(jù)Klootwijk等［3］的方法制備NTD模型。將RA溶于玉米油內(nèi)(40g/L)，按50mg/kg于孕期E7．0d～7．25d時(shí)一次性喂服孕鼠，制備NTD模型。同時(shí)正常對(duì)照組喂服等量玉米油。

1．2．2 標(biāo)本采集及大體形態(tài)觀察 在E9．5(n=16)、E10．5(n=12)時(shí)，處死正常及 NTD 孕鼠，剖腹取胎，在4倍解剖顯微鏡下確定已造成NTD發(fā)生，并分離胎盤、胎膜組織后，對(duì)鼠胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)辨別篩選，檢查活胎數(shù)、死胎數(shù)以及每個(gè)胚胎頭部、面部、脊柱、尾部等發(fā)育的外觀特征，獲得各階段腦泡及脊神經(jīng)組織，挑選典型的異常神經(jīng)管組織進(jìn)行總RNA的分離和提取。

1．2．3 總RNA的提取與檢測(cè) 用TRIZOL試劑提取總RNA，分光光度儀檢測(cè)RNA樣本濃度，最后按約 3．3μg/μl的濃度進(jìn)行稀釋分裝，15μl/管(50μg)，－80℃保存。每組取總 RNA 20μg，1% 瓊脂糖膠電泳驗(yàn)證其純度。

1．2．4 基因芯片雜交與掃描分析 取50μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，分別用 2μl Cy3－dUTP(正常對(duì)照組)或Cy5－dUTP(RA組)標(biāo)記cDNA。參照蔣立堅(jiān)等［4］的方法，用含有1100余個(gè)已知基因的中密度芯片對(duì)每組標(biāo)記的cDNA雜交。雜交后芯片用ScanAry 4000掃描儀掃描獲取微陣列圖像，掃描圖像經(jīng)斯坦福大學(xué)ScanAlyze2．51軟件分析。反復(fù)試驗(yàn)3次。

1．2．5 基因表達(dá)差異的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (1)當(dāng)2組組織中基因表達(dá)的強(qiáng)度比值(Cy5/Cy3)大于2．0或小于0．5時(shí)，即認(rèn)為它們存在差異表達(dá)，小于0．5者為RA處理后下調(diào)基因，大于2．0者為上調(diào)基因。(2)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)相同趨勢(shì)變化。(3)3次實(shí)驗(yàn)中有2次出現(xiàn)相同趨勢(shì)改變且第3次結(jié)果不矛盾。

2 結(jié)果

2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)納入60對(duì)成年昆明種小鼠，將受孕的60只雌鼠隨機(jī)分成RA組和正常對(duì)照組，每組30只。喂服RA組有2只孕鼠死亡，正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)淘汰2只孕鼠，共56只孕鼠納入了結(jié)果分析(見表1)。

表1 RA致NTD鼠胚發(fā)生率(n/%)

2．2 正常及RA作用下鼠胚的形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)于E9．5，E10．5d處死正常及NTD孕鼠，剖腹取胎，發(fā)現(xiàn)正常與經(jīng)RA處理的孕鼠的胚胎數(shù)多在8～16個(gè)。解剖顯微鏡下觀察正常E9．5，E10．5d鼠胚腦部閉合完全，外觀飽滿圓滑，腮弓清晰，眼泡、耳泡可見，脊柱表面完整無裂口;尾部細(xì)長(zhǎng)彎曲，前后肢芽出現(xiàn)。而RA組鼠胚死胎明顯增多，形態(tài)多樣;典型的形態(tài)畸形包括顱腦頂部未閉呈現(xiàn)裂口、后腦及面部異常、脊柱或尾部有裂口及無尾或短尾等

2．3 E9．5d、E10．5 正常與同期神經(jīng)管組織的差異表達(dá)基因功能分類 E9．5d－E10．5d組DNA芯片掃描圖像(見圖1～圖3)經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析，通過比較正常E9．5d與E10．5d獲得138個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因71個(gè)，下調(diào)基因67個(gè)。根據(jù)基因功能分類主要包含了細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因(32條)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(26條)，轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控(13條)，蛋白合成與調(diào)控(11條)，基質(zhì)與骨架蛋白(14條)等幾大類(見表2)。通過比較正常E9．5d與同期RA誘導(dǎo)所致NTD神經(jīng)管組織的基因表達(dá)，獲得了20個(gè)差異表達(dá)基因;按功能分類包括細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因9條，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)4條，轉(zhuǎn)錄與翻譯2條，能量與代謝基因5條(見表3)。E10．5d與同期RA作用后神經(jīng)管組織的表達(dá)差異基因有29個(gè);其中細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因8條，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因4條，轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控4條，能量與代謝基因4條，熱休克基因3條，基質(zhì)與骨架蛋白3條，其它3條(見表4)。

圖1 正常9．5d與10．5d鼠胚神經(jīng)組織的基因表達(dá)差異

表2 E9．5d－E10．5d組神經(jīng)管組織的差異表達(dá)基因功能分類

圖2 9．5d正常與RA處理神經(jīng)管組織的基因表達(dá)差異

圖3 10．5d正常與RA處理神經(jīng)管組織的基因表達(dá)差異

3 討論

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTD)，是由于在胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)管閉合不全引起的一組缺陷。主要包括無腦畸形、腦膨出、腦脊膨出和和脊柱裂等，是造成孕婦流產(chǎn)、圍產(chǎn)兒和嬰兒死亡或終身殘疾的主要原因之一。我國(guó)是已知世界神經(jīng)管缺陷的高發(fā)國(guó)，神經(jīng)管缺陷在所有出生缺陷中居首位。

RA決定胚胎頭尾軸的形成，在胚胎的發(fā)育過程中是一個(gè)重要形成因素。喂服RA的劑量不同，畸形的程度和部位也會(huì)有差異［5，6］。因此，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用按RA(50mg/kg)喂服孕期E7．0～7．25d的孕鼠，制備NTD模型。減少了由于RA喂服量的不同導(dǎo)致的不同程度的畸形和不同部位的畸形的差異。通過這種方法建立的NTD模型可靠，已為廣大學(xué)者接受認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)觀察到許多畸形胚胎包括顱腦頂部未閉、后腦和面部的異常、脊柱或尾部未閉及無尾或短尾等。這些畸形與類似研究描述相一致［7，8］。實(shí)驗(yàn)納入60對(duì)成年昆明種小鼠，喂服RA組有2只孕鼠因未進(jìn)食、飲水及走動(dòng)等原因死亡，正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)淘汰2只孕鼠，共56只孕鼠納入了結(jié)果分析。制模成功率為93．33%，我們認(rèn)為制模成功的關(guān)鍵在于喂服RA劑量及時(shí)間的嚴(yán)格控制。

表3 正常E9．5d與同期RA處理組神經(jīng)管組織的差異表達(dá)基因功能分類

表4 正常E10．5d與RA處理組神經(jīng)管組織的差異表達(dá)基因功能分類

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含有1100余個(gè)已知基因的中密度芯片，通過比較正常E9．5d與E10．5d獲得138個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因71個(gè)，下調(diào)基因67個(gè)。根據(jù)基因功能分類主要包含了細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因(32條)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(26條)，轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控(13條)，蛋白合成與調(diào)控(11條)，基質(zhì)與骨架蛋白(14條)等幾大類。通過比較正常E9．5d與同期RA誘導(dǎo)所致NTD神經(jīng)管組織的基因表達(dá)，獲得了20個(gè)差異表達(dá)基因;按功能分類包括細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因9條，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)4條，轉(zhuǎn)錄與翻譯2條，能量與代謝基因5條。E10．5d與同期RA作用后神經(jīng)管組織的表達(dá)差異基因有29個(gè);其中細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因8條，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因4條，轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控4條，能量與代謝基因4條，熱休克基因3條，基質(zhì)與骨架蛋白3條，其它3條。結(jié)果提示包括細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、能量與代謝基因、熱休克基因、基質(zhì)與骨架蛋白等多種基因參與了 NTD的發(fā)生過程。其中 NeK7、IGFBP5、ZW10、Csf3r、PSMC6、Rb1 在 RA 處理致 NTD組均呈現(xiàn)下調(diào);apoa－4在RA處理致NTD組均呈現(xiàn)上調(diào)，差異基因在時(shí)空限制性的差異表達(dá)顯示這些基因與正常神經(jīng)管的發(fā)生和RA誘導(dǎo)所致NTD密切相關(guān)。

另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在眾多種類的差異表達(dá)基因中，細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因所占比例最大，分別占正常 E9．5d－E10．5d 組差異基因的 23．2%(32/138)，E9．5dNTD 組 45%(9/20)及 E10．5dNTD 組 27．6%(8/29)。提示細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因可能在正常神經(jīng)管的發(fā)生和RA誘導(dǎo)所致NTD的過程中發(fā)揮重要作用。發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的研究認(rèn)為神經(jīng)管形成過程中準(zhǔn)確有序的細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡是保證神經(jīng)管正常發(fā)生的兩個(gè)重要因素，細(xì)胞周期中真核細(xì)胞分裂必須通過兩個(gè)重要的限制點(diǎn):即通過G1－S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)入DNA合成;G2－M期轉(zhuǎn)換進(jìn)入有絲分裂。細(xì)胞周期素(cyclin)與細(xì)胞素依賴性蛋白激酶(CDKs)［9］復(fù)合物有序的形成，活化與失活是驅(qū)使細(xì)胞周期正常循環(huán)進(jìn)行的內(nèi)在動(dòng)力同時(shí)在細(xì)胞周期的4個(gè)時(shí)相(G1，S，G2，M)，各種內(nèi)外環(huán)境因素即通過影響相關(guān)分子而參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。分析正常神經(jīng)管形成前后及RA誘導(dǎo)產(chǎn)生NTD后的差異表達(dá)基因，可以發(fā)現(xiàn)相當(dāng)部分差異表達(dá)基因與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)。多種G1期的正向調(diào)節(jié)因子在神經(jīng)管形成前后表達(dá)顯著下調(diào)，包括 CCND2，CCNE1，CCNH，Rb1，CDK4及cdc25a等，而兩種重要的細(xì)胞增殖抑制因子p18(CDK4抑制因子)，p57/kip2等表達(dá)顯著升高，表明伴隨神經(jīng)管的形成，神經(jīng)上皮阻滯于G1期的細(xì)胞顯著增多，增殖能力下降。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示與G2－M期轉(zhuǎn)換的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子CDC5L，cdc25A，cyclinA等的表達(dá)也有下調(diào)，提示在神經(jīng)管形成后可能也伴隨了G2－M期轉(zhuǎn)換過程的減弱。在RA誘導(dǎo)致 NTD(包括 E9．5D與E10．5D兩個(gè)時(shí)相)出現(xiàn)的差異表達(dá)基因中，細(xì)胞周期相關(guān)基因也是為數(shù)最多的一類，其中 Rb1，Ccnd2，Nek7及ZW10下調(diào)提示存在G1期的阻滯。但與正常神經(jīng)管形成過程中基因表達(dá)變化不同的是一些細(xì)胞周期相關(guān)基因包括p57kip2，CDK5等在RA作用后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)(在正常神經(jīng)管形成后呈上調(diào))。P57kip2是多種G1期調(diào)解子的重要抑制劑，當(dāng)它與cyclinECDK2，cyclinD2－CDK4 及 cyclinA－CDK2 等結(jié)合后，作為細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)節(jié)因子抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，是維持機(jī)體非增殖狀態(tài)的關(guān)鍵因子之一［10］。P57kip2的表達(dá)改變與細(xì)胞凋亡發(fā)生密切關(guān)聯(lián)［11］。但P57kip2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用尚不十分清楚。CDK5雖然作為細(xì)胞周期家族的成員之一，目前對(duì)于其在細(xì)胞分裂中的作用尚不明確。相反，關(guān)于它參與分裂后神經(jīng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等的研究較多，觀察發(fā)現(xiàn)敲除CDK基因的小鼠有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)于障礙，甚至出現(xiàn)胚胎期致使的嚴(yán)重缺陷［12］，提示CDK5是CNS發(fā)育必要的關(guān)鍵基因之一。近年來多數(shù)研究提示CDK5主要參與了分裂后神經(jīng)細(xì)胞的遷移，軸突生長(zhǎng)與導(dǎo)向等作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)于成熟過程中扮演了重要作用［13，14］，其表達(dá)隨著細(xì)胞逃逸出細(xì)胞周期而逐漸升高。CDK5參與對(duì)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路上靶蛋白的磷酸化作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到NTD發(fā)生時(shí)CDK5的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，提示在RA作用后可能改變了CDK5對(duì)神經(jīng)上皮的作用。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)的一些基因差異表達(dá)，如 Fasn，Cpt1a，Nr2f2 和 Apoa－4。其中 FASN 在RA作用下呈現(xiàn)下調(diào)，而 Cptla，NR2F2，和載脂蛋白A4在RA作用下表達(dá)上調(diào)，提示脂類代謝異?？赡苁?NTD 的發(fā)生一個(gè)重要因素［15～22］。IGFBP5 作為IGF結(jié)合蛋白家族的一員，其作用與IGF密切相關(guān)，在腦發(fā)育中IGFBP5有較高表達(dá)，并參與小腦皮質(zhì)的發(fā)育和海馬形成等［23，24］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) IGFBP5在 RA組表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)該基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有特殊作用。

總之，實(shí)驗(yàn)通過基因芯片技術(shù)篩選出部分正常胚胎同NTD小鼠神經(jīng)管組織的差異基因，根據(jù)相關(guān)基因已報(bào)道的功能，提示包括包括細(xì)胞周期家族等多種基因參與了NTD的發(fā)生過程;結(jié)果同時(shí)也為研究正常神經(jīng)胚形成的分子機(jī)制提供了有益線索。

［1］Harris MJ，Juriloff DM．Mini－review:toward understanding mechanisms of genetic neural tube defects in mice［J］．Teratology，1999，60(5):292－305．

［2］Wu J，Smith LT，Plass C，et al．ChIP－chip comes of age for genomewide functional analysis［J］．Cancer Res，2006，66(14):6899 －6902．

［3］Klootwijk R，Schijvenaars MM，Mariman EC，et al．Further characterization of the genetic defect of the Bent tail mouse，a mouse model for human neural tube defects［J］．Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2004，70(11):880 －884．

［4］蔣立堅(jiān)，賴仁發(fā)，李衛(wèi)國(guó)，等．基因芯片篩選成釉細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因的研究［J］．中國(guó)病理生理雜志，2008，24(5):992 －996．

［5］Maden M，Gale E，Kostetskii I，et al．Vitamin A－deficient quail embryos have half a hindbrain and other neural defects［J］．Curr Biol，1996，6(4):417 －426．

［6］Alles AJ，Sulik KK．Retinoic acid－induced spina bifida:evidence for a pathogenetic mechanism［J］．Development，1990，108(1):73 －81．

［7］Ross SA，McCaffery PJ，Drager UC，et al．Retinoids in embryonal development［J］．Physiol Rev，2000，80(3):1021 － 1054．

［8］Clagett－Dame M，DeLuca HF．The role of vitamin A in mammalian reproduction and embryonic development［J］．Annu Rev Nutr，2002，22:347－381．

［9］Bremmer SC，Hall H，Martinez JS，et al．Cdc14 phosphatases preferentially dephosphorylate a subset of cyclin－dependent kinase(Cdk)sites containing phosphoserine［J］．J Biol Chem，2012，287(3):1662－1669．

［10］Heinen A，Kremer D，G?ttle P，et al．The cyclin－dependent kinase inhibitor p57kip2 is a negative regulator of Schwann cell differentiation and in vitro myelination［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，6(3):8748－8753．

［11］Gonzalez S，Perez－Perez MM，Hernando E，et al．p73beta－Mediated apoptosis requires p57kip2 induction and IEX－1 inhibition［J］．Cancer Res，2005，65(6):2186 －2192．

［12］Trunova S，Giniger E．Absence of the Cdk5 activator p35 causes adult－onset neurodegeneration in the central brain of Drosophila［J］．Dis Model Mech，2012，5(2):210 －219．

［13］Huber RJ，O’Day DH．The cyclin－dependent kinase inhibitor roscovitine inhibits kinase activity，cell proliferation，multicellular development，and Cdk5 nuclear translocation in Dictyostelium discoideum［J］．J Cell Biochem，2012，113(3):868 －876．

［14］Cheung ZH，Ip NY．Cdk5:a multifaceted kinase in neurodegenerative diseases［J］．Trends Cell Biol，2012，22(3):169 －175．

［15］Ross J，Najjar AM，Sankaranarayanapillai M，et al．Fatty acid synthase inhibition results in a magnetic resonance－detectable drop in phosphocholine［J］．Mol Cancer Ther，2008，7(8):2556 －2565．

［16］Wolfgang MJ，Cha SH，Millington DS，et al．Brain－specific carnitine palmitoyl－transferase－1c:role in CNS fatty acid metabolism，food intake，and body weight［J］．J Neurochem，2008，105(4):1550 －1559．

［17］Xu Q，Walther N，Jiang H．Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II(COUP－TFII)and hepatocyte nuclear factor 4gamma(HNF－4gamma)and HNF－4alpha regulate the bovine growth hormone receptor 1A promoter through a common DNA element［J］．J Mol Endocrinol，2004，32(3):947 －961．

［18］Maier T，Leibundgut M，Ban N．The crystal structure of a mammalian fatty acid synthase［J］．Science，2008，321(5894):1315 －1322．

［19］Bonnefont JP，Djouadi F，Prip－Buus C，et al．Carnitine palmitoyltransferases 1 and 2:biochemical，molecular and medical aspects［J］．Mol Aspects Med，2004，25(5 －6):495 －520．

［20］Jiang H，Lucy MC，Crooker BA，et al．Expression of growth hormone receptor 1A mRNA is decreased in dairy cows but not in beef cows at parturition［J］．J Dairy Sci，2005，88(4):1370 －1377．

［21］Shen L，Pearson KJ，Xiong Y，et al．Characterization of apolipoprotein A－IV in brain areas involved in energy homeostasis［J］．Physiol Behav，2008，95(1 －2):161 －167．

［22］Shen L，Tso P，Woods SC，et al．Hypothalamic apolipoprotein A－IV is regulated by leptin［J］．Endocrinology，2007，148(6):2681 －2689．

［23］Valentinis B，Baserga R．IGF－I receptor signalling in transformation and differentiation［J］．Mol Pathol，2001，54(3):133 － 137．

［24］Bondy C，Lee WH．Correlation between insulin－like growth factor(IGF)－binding protein 5 and IGF－I gene expression during brain development［J］．J Neurosci，1993，13(12):5092 － 5104．