效應(yīng)面法優(yōu)化對甲氧基肉桂酸乙酯的包合工藝

劉雪梅，李繼英，蘇霞

(廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西南寧530001)

沙姜是姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根莖，溫中化濕，行氣止痛，主治胃寒疼痛、牙痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷，藥用價(jià)值較高［1］。沙姜也是一味常用的壯藥(壯藥名為Sagieng)，用于治療咳嗽和肺病、促進(jìn)傷口愈合，壯族人民早已使用它并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)［2］。除藥用外，還大量用作副食和調(diào)味劑。

據(jù)報(bào)道，山柰揮發(fā)油抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對化療藥物有協(xié)同增效作用;而揮發(fā)油中的肉桂酸酯類化合物，尤其是主要成分-反式和順式的對甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)有抗促癌活性［3-6］。由于植物藥遺傳毒性低，因此對甲氧基肉桂酸乙酯有較強(qiáng)的抗腫瘤利用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。但是對甲氧基肉桂酸乙酯不溶于水，嚴(yán)重影響了它的生物利用度［7-8］。而β-環(huán)糊精不僅能提高藥物的溶解度，還能改善藥物的生物利用度和穩(wěn)定性。

國內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)或正交設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化和處方篩選，但這兩種方法精度不夠，預(yù)測性不佳，國外很少采用。星點(diǎn)設(shè)計(jì)和效應(yīng)面優(yōu)化法是國外藥學(xué)工作者常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法，優(yōu)選條件預(yù)測性好;近年來國內(nèi)時(shí)有該法用于藥學(xué)研究的報(bào)道［9-13］。本實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法制備對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其最佳的制備工藝，為方便對甲氧基肉桂酸乙酯的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

1 儀器和材料

85-2恒溫磁力攪拌器(武漢精華科研儀器公司);Nexus470傅立葉紅外拉曼光譜儀(美國Nicolet公司);AE100電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);GC—14A氣相色譜儀(日本島津公司);FW 24A型壓片機(jī)(天津光學(xué)儀器廠);Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)(美國安捷倫公司);CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜儀(瑞士卡瑪公司)。

對甲氧基肉桂酸乙酯(武漢合中化工有限公司，批號:20070802，純度≥99.0%);對甲基肉桂酸乙酯(批號:0835-9601，購自中國藥品生物制品檢定所);β-CD(廣東省郁南順中食品貿(mào)易有限公司);其余試劑為分析純，色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的制備［14］

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，采用飽和水溶液法制備。在一定溫度下，稱取一定量的β-CD溶于水中，加熱溶解，制成飽和溶液;同時(shí)稱取一定量的對甲氧基肉桂酸乙酯溶于95%乙醇中。待β-CD飽和溶液稍冷后，用恒壓分液漏斗將對甲氧基肉桂酸乙酯乙醇溶液緩慢滴入飽和溶液中，恒溫40℃攪拌。繼續(xù)攪拌一定時(shí)間后，停止加熱，繼續(xù)攪拌，降至室溫，靜置，冷藏24 h，得沉淀，抽濾，洗滌，45℃干燥，稱質(zhì)量，得白色粉末狀的對甲氧基肉桂酸乙酯包合物。

2.2 包合率和包合物產(chǎn)率測定氣相色譜法測定包合物中對甲氧基肉桂酸乙酯［15］。

2.2.1 色譜條件SE-30石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。柱溫200℃，進(jìn)樣口溫度與檢測器溫度為250℃，載氣為氮?dú)狻?/p>

2.2.2 定量測定

2.2.2.1 樣品溶液制備精密稱取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品適量，加入甲醇超聲30 min，完全溶解后加甲醇至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。精密稱取適量包合物置量瓶中，加適量甲醇超聲處理，溶解后加至刻度，搖勻制成供試液。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液分別配成質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/mL的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各4 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積。以各質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6×106x－205 745，r=0.999 5，表明對甲氧基肉桂酸乙酯在0.3～4 μg/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。對該方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、24 h穩(wěn)定性測定、加樣回收試驗(yàn)，得到對甲氧基肉桂酸乙酯的RSD分別為1.95%、1.36%、2.65%，回收率為101.65%。(n=5)

氣相色譜法測定供試液的對甲氧基肉桂酸乙酯，每批3次，計(jì)算包合率和包合物產(chǎn)率。

包合率和包合產(chǎn)率的計(jì)算公式如下:

2.3 包合物的鑒定

2.3.1 紅外光譜法分別測定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD物理混合物、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物、對甲氧基肉桂酸乙酯的溴化鉀壓片、β-CD的溴化鉀壓片在室溫下進(jìn)行紅外光譜，掃描范圍為500～4 000 cm－1。結(jié)果見圖1。由圖可知，物理混合物的IR呈現(xiàn)出藥物和β-CD的疊加峰型特征。其—OH峰位(3 385.73 cm－1)與藥物的—OH峰位(3 387.48 cm－1)一致，C峰位(1 631.29 cm－1)和藥物的CO峰位(1 630.10 cm－1)一致，C—H峰位(2 924.92 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)一致;而包合物的IR與物理混合物明顯不同，某些特征峰向高波數(shù)位移，強(qiáng)度大為減弱，如CO峰位升高(由1 630.10升至1 643.32 cm－1);某些特征峰向低波數(shù)位移，強(qiáng)度大為減弱，如—OH峰位降低(從3 387.48降至3 373.62 cm－1)，而包合物與β-CD的IR很相似，如C—H峰位(2 930.25 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)相近，表明了藥物與β-CD產(chǎn)生了包合作用;但二者仍存在明顯差異。

2.3.2 薄層色譜法分別精密稱取適量對甲氧基肉桂酸乙酯、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，用無水乙醇定容至2 mL;精密稱取包合物適量，加入石油醚，振蕩，洗滌，自然揮干醚液，用無水乙醇定容。各取10 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶0.5∶1.5)為展開劑展開，取出晾干，紫外儀366 nm下檢視;再以5%磷鉬酸溶液顯色，105℃烘干。結(jié)果顯示366 nm下可見對甲氧基肉桂酸乙酯醇溶液、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醇液Rf值基本一致，而對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醚洗溶液相應(yīng)位置無斑點(diǎn)，表明對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物已形成，見圖2。

2.3.3 紫外分光光度法精密稱取適量對甲氧基肉桂酸乙酯原藥、β-CD、對甲氧基肉桂酸乙酯+β-CD、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物(含有對甲氧基肉桂酸乙酯量相當(dāng)于原藥質(zhì)量)，5 mL無水乙醇溶解后加入蒸餾水定容至100 mL，以溶劑為空白溶液，于紫外分光光度計(jì)中在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果對甲氧基肉桂酸乙酯在210、225、309 nm處有最大吸收，β-CD和溶劑在λmax處無吸收干擾。包合物與原藥的吸收圖譜基本相同，只是吸收強(qiáng)度稍減，表明包合物形成過程為一物理包合過程，未與β-CD發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，包合物基本形成。紫外吸收光譜見圖3。

圖1 β-環(huán)糊精(a)、對甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of β-CD(a)，MEC(b)，β-CD+MEC mixtures(c)and inclusion complexes(d)

圖2 對甲氧基肉桂酸乙酯、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of MEC and inclusion complex

2.4 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，確定用藥比例(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)為星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察的影響因素，其水平范圍為:用藥比例為10%～20%，包合溫度為30～50℃，包合時(shí)間為30～150 min。以對甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產(chǎn)率為考察指標(biāo)。其中，包合率為工藝篩選的主要指標(biāo);在β-CD和對甲氧基肉桂酸乙酯投料量一定的情況下，包合物產(chǎn)率為次要指標(biāo)。采用三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1、表2。

圖3 對甲氧基肉桂酸乙酯(a)、β-CD(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的此外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of MEC(a)，β-CD(b)，MEC+β-CD mixtures(c)and MEC-β-CD inclusion complexes(d)

2.5 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析將表2中對甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產(chǎn)率的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化為0～1間的歸一值，通過數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換得到總評歸一值(總評OD值)。以用藥比例、包合溫度和包合時(shí)間為自變量，以各總評歸一值對自變量進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合，以復(fù)相關(guān)系數(shù)(r)和P＜0.05為模型判定標(biāo)準(zhǔn)，Statistica 6.0軟件繪制效應(yīng)面確定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的最佳工藝。結(jié)果如下:

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果(n=3)Tab.2 Result of central composite design(n=3)

多元線性擬合方程:y(OD)=－0.799 1+0.004 2X1+0.026 8X2+0.001 9X3，r=0.644 4，F(xiàn)(3，11)=2.603 4，P=0.104 7＞0.05，表明線性擬合不佳，不宜用線性模型。

二項(xiàng)式擬合方程:y(OD)=－12.744 6+0.663 8X1+0.332 2X2+0.032 0X3－0.000 6X1X2+0.000 6×10－2X1X3－0.000 1X2X3－0.021 2X21+0.003 6X22－0.000 2X23，r=0.839 2，相對于線性擬合有大幅提高，但有多項(xiàng)系數(shù)值的P值＞0.05，應(yīng)對方程刪項(xiàng)簡化，提高其可信度。本實(shí)驗(yàn)以該方程作為分析及模型的預(yù)測，故未將模型進(jìn)一步簡化。

由于效應(yīng)面圖只能表達(dá)含2個(gè)自變量的函數(shù)，故本實(shí)驗(yàn)固定其中1個(gè)自變量為中值，另外2個(gè)影響因素為自變量，總評OD值為因變量，以擬合的二項(xiàng)式方程為數(shù)學(xué)模型，繪制效應(yīng)面圖，并從效應(yīng)面上選取最佳的實(shí)驗(yàn)條件。見圖4～6。

圖4 用藥比例和包合溫度及其相互作用對總評OD值的影響(包合時(shí)間90 min)Fig.4 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion temperature(with time of 90min)

圖5 用藥比例和包合時(shí)間及其相互作用對總評OD值的影響(包合溫度40℃)Fig.5 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion time(with temperature of 40℃)

圖6 包合溫度和包合時(shí)間及其相互作用對總評OD值的影響(用藥比例15%)Fig.6 Correlative effects of inclusion temperature and time(with 15%proportion of MEC)

由圖4～6可知，總評OD值隨著用藥比例、包合時(shí)間和包合溫度的增加，先增加后降低。結(jié)合包合物制備的實(shí)際情況，確定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的較佳工藝為:用藥比例為15%，溫度為45℃，時(shí)間為90 min。經(jīng)過3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得OD平均值為0.972 2，與模型方程理論預(yù)測值(0.994 8)的偏差為－2.26%，表明本工藝二項(xiàng)式擬合效果良好，可信度高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，選用飽和水溶液法制備包合物，操作簡便，適于工業(yè)化生產(chǎn);采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選包合物的制備工藝，預(yù)測性好，為下一步研制對甲氧基肉桂酸乙酯包合物的新劑型奠定了基礎(chǔ)。

鑒于前期實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間的限制，本實(shí)驗(yàn)后期將進(jìn)行對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的溶解性變化、體外釋放度和穩(wěn)定性試驗(yàn)，為優(yōu)化對甲氧基肉桂酸乙酯包合物工藝設(shè)計(jì)提供定量的科學(xué)依據(jù)。

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