HPLC法同時(shí)測(cè)定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素

倪 琳， 楊 錫

(甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅省中藥品質(zhì)與安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000)

生脈飲收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，由紅參、麥冬、五味子組成，具有益氣復(fù)脈，養(yǎng)陰生津。用于氣陰兩虧，心悸氣短，脈微自汗［1］。原標(biāo)準(zhǔn)有紅參、麥冬的薄層色譜鑒別，無(wú)定量測(cè)定項(xiàng)。方中五味子的主要有效成分為五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Alliance e2695四元泵，Waters 2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器;Mettler AE240電子天平。

1.2 試藥 五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-200709)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào):0764-200107)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào):110765-200205)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;生脈飲樣品由甘肅普安制藥有限公司提供;甲醇為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲0.021 72 mg、五味子甲素0.018 54 mg、五味子乙素0.021 72 mg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密吸取本品10 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按供試品的處方和制法，制成不含五味子的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱選用CAPCELL PAK C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相為梯度洗脫:Ⅰ.甲醇-水(65∶35)(0～12 min):Ⅱ.甲醇-水(75 ∶25)(12 ～45 min);Ⅲ.甲醇-水(65∶35)(45～50 min);檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm;體積流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL;柱溫為30℃。理論板數(shù)按五味子醇甲計(jì)算應(yīng)不低于5 000。對(duì)照品，供試品以及陰性對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照無(wú)干擾。

圖1 混合對(duì)照品(A)、生脈飲樣品(B)和陰性對(duì)照樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，Shengmai Oral Liquid sample(B)and negative sample(C)

2.5 工作曲線與線性關(guān)系 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 8、10、15、20、25、30 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為縱坐標(biāo)(Y)，分別得到回歸方程:

五味子醇甲Y=1.768 4×10-7X-2.451 9×10-3，r=0.999 8。

五味子甲素Y=1.641 8×10-7X-5.722 0×10-3，r=0.999 9。

五味子乙素Y=1.625 6×10-7X-7.874 5×10-4，r=0.999 8。

結(jié)果表明，五味子醇甲在0.173 8 μg～0.651 6 μg、五味子甲素 0.148 3 μg ～0.556 2 μg、五味子乙素0.173 8 μg～0.651 6 μg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，五味子醇甲R(shí)SD為0.67%、五味子甲素RSD為1.16%、五味子乙素RSD為1.27%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，結(jié)果在10 h內(nèi)供試品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積穩(wěn)定，RSD分別為1.21% 、1.23% 、1.05% 。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取生脈飲樣品6份，每份精密吸取10 mL，按供試品溶液制備方法制備，在確定的色譜條件下進(jìn)行分析，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素RSD分別為0.87%、1.11%、1.35%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的供試品(批號(hào):20100502)6份，每份精密吸取5 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入一定量的五味子醇甲對(duì)照品(0.140 2 mg/L)、五味子甲素對(duì)照品(0.055 mg/L)、五味子乙素對(duì)照品(0.057 mg/L)對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，即得。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.10 樣品的測(cè)定 取3批生脈飲按供試品溶液的制備方法制成供試液，分別進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值，計(jì)算生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的質(zhì)量濃度。見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of sample determination(n=3)

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇 曾試驗(yàn):①加甲醇提取樣品，測(cè)得總量為0.201 mg/mL;②加甲醇超聲提取樣品，測(cè)得總量為0.202 mg/mL;③加三氯甲烷萃取樣品，測(cè)得總量為0.086 mg/mL;④加乙酸乙酯超聲提取樣品［2］，測(cè)得總量為0.196 mg/mL。結(jié)果表明，4種提取方法其中方法①和方法②質(zhì)量濃度較方法③、④高，且方法①提取方法較簡(jiǎn)便，所以選擇方法①作為樣品提取方法。

3.2 流動(dòng)相的選擇 曾試驗(yàn):乙腈-甲醇-水(15∶15∶10)［2-3］;甲醇-水［4-8］;甲醇-水-冰醋酸(75 ∶25 ∶0.1)［9］;以甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫［10］;以甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，采用梯度洗脫:0～5 min，A-B(30∶70);5～40 min，A-B(25∶75);40 ～45 min，A-B(32 ∶68)［11］;用以上5 種流動(dòng)相測(cè)定，生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素均達(dá)不到基線分離，再試驗(yàn)摸索確定以甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，采用梯度洗脫:0～12 min，A-B(65∶35);12 ～45 min，A-B(75 ∶25);45 ～50 min，A-B(65∶35)生脈飲中3種成分達(dá)到基線分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 曾參考文獻(xiàn)［2-9］檢測(cè)波長(zhǎng)選在250 nm、254 nm，結(jié)果生脈飲中五味子甲素、五味子乙素積分值較低，采用DAD在190 nm～400 nm全波長(zhǎng)掃描，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在220 nm均有最大吸收，故選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:653-654.

［2］吳曉鳳，陳 虹.HPLC法測(cè)定生脈飲中五味子醇甲的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(1):39-40.

［3］白淑芳，陳 虹，李靈芝.HPLC測(cè)定華中五味子中五味子甲素含量［J］.天津藥學(xué)，2001，13(3):67-68.

［4］張新奎，王育紅.HPLC法測(cè)定生脈飲中五味子乙素的含量［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2005，33(4):15-16.

［5］段金梅，羅捷華.HPLC法測(cè)定生脈飲中五味子醇甲的含量［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，25(1):33-35.

［6］馮 華，張超云，鄒孔強(qiáng).HPLC法測(cè)定棗仁安神片中五味子醇甲的含量［J］. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，15( 1) : 82-83.

［7］古海峰，張小茜，郭洪祝.HPLC法測(cè)定復(fù)方益肝靈片中五味子醇甲的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(2):295-297.

［8］曲 佳，郭秀霞，周 軍.HPLC法測(cè)定參芪消渴膠囊中五味子醇甲的含量［J］.天津藥學(xué)，2009，21(6):13-15.

［9］程啟文，牛字東，趙 鳴.HPLC法測(cè)定健肝靈膠囊中五味子甲素的含量［J］.陜西中醫(yī)，2008，29(10):1400-1402.

［10］趙 玥，王 冰.遼城鳳城地區(qū)不同生長(zhǎng)環(huán)境五味子5中木脂素成分含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(16):64-66.

［11］李 寶，王春暉.HPLC法測(cè)定五味子浸膏中三種成分的含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(4):436-437.

［12］姚 瑩，上官盈盈，王 瑋.HPLC法測(cè)定北五味子果實(shí)、藤莖超臨界萃取物中木脂素的含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(21):1661-1663.