斷血流皂苷的大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究

劉麗敏， 年四輝， 劉東平， 徐貴明

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241002)

斷血流為唇形科植物蔭風(fēng)輪Clinopodium polycephalum(Vaniot)C.Y.Wu et Hsuan或風(fēng)輪菜Clinopodium chinensis(Benth.)O.Kuntze的干燥地上部分，具有止血之功，常用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血、子宮肌瘤等出血癥的治療［1］，化學(xué)成分主要包括皂苷、黃酮、氨基酸、多糖、酚性成分和揮發(fā)油等成分［2］，斷血流總皂苷是其發(fā)揮止血作用的主要成分［3］。近年來(lái)大孔樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于富集中藥有效成分如皂苷、生物堿、黃酮類等成分［4-6］，大孔樹(shù)脂應(yīng)用于純化斷血流總皂苷的研究也有文獻(xiàn)報(bào)道［7］，但在該研究中選擇的樹(shù)脂型號(hào)較少，總苷的純度相對(duì)較低。為更好的指導(dǎo)皂苷純化工藝，課題組在解決酶法水提取斷血流皂苷的基礎(chǔ)上［8］，采用靜態(tài)吸附法考察11種樹(shù)脂對(duì)斷血流皂苷的吸附、解吸附作用及純化效果，并結(jié)合動(dòng)態(tài)吸附初步篩選出合適的大孔吸附樹(shù)脂，為斷血流皂苷的純化工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 斷血流(購(gòu)于安徽省亳州中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為蔭風(fēng)輪的地上部分);斷血流皂苷A(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110782-200301);大孔樹(shù)脂D101、AB-8(安徽三星樹(shù)脂有限公司)、D101-I、DM130、DM301、DA201、NKA-9(天津海光)、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600(滄州寶恩化工);ZTC1+1澄清劑II型(北京正天成澄清技術(shù)有限公司);LC-20A高效液相色譜儀(日本島津);2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);KQ5200B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HY-5回旋振蕩器(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司);提取用水為蒸餾水，色譜用水為樂(lè)百氏純凈水，甲醇為色譜純，高氯酸為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斷血流提取液制備 稱取斷血流粗粉1 000 g，加入pH為7.0的水10 000 mL，60℃溫度下加入5 U/g纖維素酶，酶解40 min后，微沸提取1 h，過(guò)濾，續(xù)加 10 000 mL水，微沸加熱1 h［8］，合并兩次提取液，加入ZTC1+1絮凝劑澄清，過(guò)濾，濃縮至5 000 mL，4℃冷藏備用。

1.2.2 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理［9］稱取適量大孔樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h，使之充分膨脹后上柱，以95%乙醇洗至流出液與水混合不產(chǎn)生混濁為止，然后用蒸餾水洗至無(wú)醇味，再以2倍柱體積的5%NaOH洗滌，蒸餾水洗至中性，續(xù)用2倍柱體積的5%HCl洗滌，蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.2.3.1 斷血流皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取于五氧化二磷中干燥至恒質(zhì)量的斷血流皂苷A 5.08 mg，甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，配制成0.203 mg/mL的溶液，備用。

1.2.3.2 斷血流皂苷總苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［10］分別精密量取 1.2.3.1 項(xiàng)下溶液 50 μL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.6 mL于10 mL量瓶中，水浴蒸干，精密加入高氯酸5 mL，65℃水浴15 min，取出，冰水冷卻至室溫，分別加甲醇至刻度配制成 1.02、2.03、4.06、8.12、16.24、20.33、32.48 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于320 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.022 7X+0.006 4，R2=0.999，斷血流皂苷 A 在 4.06 ～32.48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求。

1.2.3.3 斷血流皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［11］色譜條件為L(zhǎng)ichrospher C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，測(cè)定波長(zhǎng) 250 nm，流動(dòng)相為甲醇-水(80∶20)，體積流量為1 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為 10 μL。

分別精密量取1.2.3.1 項(xiàng)下溶液 0.1、0.5、1、2、4、8 mL至10 mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，分別配制成2.03、10.16、20.33、40.66、81.31、162.62 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，250 nm波長(zhǎng)測(cè)定，以積分面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=11 778X+97.169，R2=0.999 8，斷血流皂苷 A 在2.03 ～162.62 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求。

1.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸 精密量取10 mL處理好的樹(shù)脂，裝入150 mL具塞錐形瓶中，加入120 mL斷血流提取液，20℃的條件下恒溫振蕩10 h，吸附結(jié)束后，取1 mL以0.45 μm濾膜過(guò)濾，待用;樹(shù)脂除去殘留液后取80%乙醇60 mL分兩次進(jìn)行解吸附，每次0.5 h，合并解吸液，取1 mL以0.45 μm濾膜過(guò)濾，待用。各樣品根據(jù)式(1)計(jì)算各樹(shù)脂對(duì)斷血流皂苷A的吸附量(Q);根據(jù)式(2)計(jì)算解吸率(D)。

式中:C1為斷血流皂苷(斷血流皂苷A)溶液起始質(zhì)量濃度，C2為吸附結(jié)束后溶液中斷血流皂苷(斷血流皂苷A)質(zhì)量濃度，Cd為解吸液中總皂苷(斷血流皂苷A)的質(zhì)量濃度，單位mg/mL;V0為吸附液體積，Vd為解吸液體積，單位mL;Ms為大孔樹(shù)脂質(zhì)量(除去水分后的干質(zhì)量)，Mg為解析液真空干燥后固形物質(zhì)量，單位g。

1.4 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附考察

1.4.1 比吸附量的考察 取1.2.2項(xiàng)下處理好的D101、D101-I、HPD300、DM301 樹(shù)脂各30 mL，裝柱，以2 BV/h 體積流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，每10 mL分段收集流出液，至流出液中可以檢測(cè)到總皂苷時(shí)停止上樣，根據(jù)式(1)計(jì)算上述樹(shù)脂比吸附量。

1.4.2 洗脫液體積分?jǐn)?shù)及純度考察 1.4.1項(xiàng)下各上樣后樹(shù)脂，取60 mL蒸餾水以2 BV/h體積流量洗去柱中水溶性雜質(zhì)后，分別用 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇各60 mL以1 BV/h體積流量進(jìn)行洗脫，分段收集，測(cè)定斷血流皂苷A后水浴揮去乙醇，減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，根據(jù)式(3)計(jì)算純度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附結(jié)果 從表1可以看出，以總苷吸附量進(jìn)行評(píng)價(jià)，DM130、HPD600、HPD450、HPD100、HPD300 型吸附樹(shù)脂具有較大的吸附量，且吸附量與其比表面積有一定相關(guān)性，比表面積大，吸附量相對(duì)較大;吸附量與樹(shù)脂的極性也有一定相關(guān)性，總體來(lái)看，極性小的的樹(shù)脂具有較大的吸附量;以總皂苷解吸率進(jìn)行評(píng)價(jià)，D101、D101-I、HPD300、AB-8、DM301具有相對(duì)高的解吸率。斷血流皂苷A的吸附量相對(duì)較少，可能為斷流皂苷A在藥材中的含有量較少，若其達(dá)到飽和吸附，總皂苷的吸附率會(huì)較低。綜合考慮總皂苷及斷血流皂苷 A的吸附量、解析率，初步選擇 D101、D101-I、HPD300、DM301做進(jìn)一步動(dòng)態(tài)考察。

表1 各廠家大孔樹(shù)脂物理性能及對(duì)斷血流總苷、斷血流皂苷A吸附量、解吸率

2.2 動(dòng)態(tài)比吸附量的考察 動(dòng)態(tài)吸附量考察結(jié)果表明，以總皂苷計(jì)D101的吸附量為40.09 mg/g、D101-I的吸附量為46.85 mg/g、HPD300的吸附量為50.77 mg/g、DM301的吸附量為33.34 mg/g。相對(duì)于靜態(tài)吸附量來(lái)說(shuō)，動(dòng)態(tài)吸附的量變小，并因動(dòng)態(tài)吸附考慮到成分泄露問(wèn)題一般不能達(dá)到飽和吸附。

2.3 洗脫體積分?jǐn)?shù)及純度考察 從圖1、表2可以看出，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)斷血流皂苷A有一定選擇性，主要集中在50%～80%乙醇洗脫部位，在該洗脫體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)斷血流皂苷 A 分別解吸附 17.833 mg、11.418 mg、20.366 mg、19.885 mg，斷血流皂苷 A的純度分別為5.56%、1.93%、4.52%、3.85%，其中D101-I主要集中在70% ～80%洗脫部位，HPD300主要集中在60% ～80%洗脫部位，且斷血流皂苷A在該部位的純度較高。在40%以前體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫部分UV法測(cè)定總皂苷的含有量較少或沒(méi)有，采用HPLC法測(cè)定斷血流皂苷A的含有量也較少或沒(méi)有被洗脫，但此部分固形物質(zhì)量較高，在具體工藝中可考慮上樣后先用40%乙醇或者更高體積分?jǐn)?shù)乙醇洗去雜質(zhì)部分，然后用80%乙醇進(jìn)行解吸附。

圖1 4種樹(shù)脂洗脫曲線

表2 采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫后4種樹(shù)脂洗脫物中斷血流皂苷A純度

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 結(jié)合2.3項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分取上述4種樹(shù)脂各30 mL裝柱，分別取1.2.1項(xiàng)下溶液200 mL以2 BV/h體積流量上柱后，取60 mL蒸餾水以2 BV/h體積流量洗去柱中水溶性雜質(zhì)，D101、HPD300兩種樹(shù)脂先用40%乙醇后用80%乙醇洗脫，D101-I、DM301兩種樹(shù)脂先用50%乙醇后用80%乙醇洗脫，洗脫劑的用量皆為60 mL，體積流量皆為1 BV/h，分段收集，測(cè)定斷血流皂苷A后水浴揮去乙醇，減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，計(jì)算純度。重復(fù)3次，斷血流皂苷A的平均純度 D101為 5.07%、D101-I為 5.63%、HPD300為4.74%、DM301為6.24%。4種樹(shù)脂對(duì)斷血流皂苷A的都具有一定的純化效果，但應(yīng)用D101、D101-I型樹(shù)脂斷血流皂苷A的解吸率偏低，應(yīng)用HPD300型樹(shù)脂斷血流皂苷A純度稍低，綜合評(píng)價(jià)，DM301型樹(shù)脂是合適的吸附樹(shù)脂。

3 討論與結(jié)論

斷血流總皂苷是斷血流藥材及其制劑中的藥效部位，斷血流皂苷A是其質(zhì)量控制指標(biāo)，但斷血流皂苷A在藥材中的含有量較低，不到千分之一［12］。在指標(biāo)選擇中，我們選擇總皂苷與斷血流皂苷A兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，兼顧總有效部位及指標(biāo)成分，在保證斷血流總皂苷不損失的前提下盡可能的提高斷血流皂苷A在提取物中含有量，并以此進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)、篩選樹(shù)脂。

目前市售的大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)較多，影響大孔吸附樹(shù)脂吸附的因素也較多，樹(shù)脂的極性、比表面積、孔徑、生藥質(zhì)量濃度、吸附體積流量等因素都會(huì)影響到樹(shù)脂的吸附量。本實(shí)驗(yàn)中以吸附量、解吸率、純度為指標(biāo)采用靜態(tài)吸附結(jié)合動(dòng)態(tài)吸附對(duì)產(chǎn)自3個(gè)廠家的11種不同極性的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行考察，初步篩選出對(duì)斷血流皂苷A選擇性較好的DM301型樹(shù)脂，吸附樣品后的樹(shù)脂分別以2 BV樹(shù)脂體積的50%及80%乙醇以1 BV/h體積流量洗脫，80%洗脫部分?jǐn)嘌髟碥誂的含有量可達(dá)到6.24%。然而，大孔樹(shù)脂工藝富集藥效成分的工藝較為復(fù)雜，仍需對(duì)選定的樹(shù)脂做使用次數(shù)、再生條件等進(jìn)一步考察。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:306.

［2］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(下)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:3141-3142.

［3］遲海東，路金才.風(fēng)輪菜屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(2):123-128.

［4］劉 艷，田 吉，何 兵，等.大孔吸附樹(shù)脂純化楤木總皂苷的工藝研究［J］.中草藥，2011，42(4):694-697.

［5］李書(shū)華，陳封政，黃曉輝，等.附子中生物堿正交提取工藝和吸附樹(shù)脂的篩選研究［J］.中成藥，2010，32(8):1419-1421.

［6］王麗婷，王麗娟.大孔樹(shù)脂分離純化金銀花葉中的總黃酮［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25(5):575-576.

［7］張 毅，鄢 丹，韓玉梅.大孔吸附樹(shù)脂純化斷血流總皂苷工藝研究［J］.中藥材，2005，28(10):942-945.

［8］劉麗敏，年四輝，吳海振.纖維素酶法提取斷血流皂苷的工藝研究［J］.中成藥，2011，33(1):165-167.

［9］許 亮，師俊玲，陳志娜，等.大孔樹(shù)脂分離純化寧夏枸杞總黃酮的研究［J］.離子交換與吸附，2011，27(3):202-211.

［10］岳 磊，朱丹妮，嚴(yán)永清，等.生脈散制劑中總皂苷含量的測(cè)定［J］.中成藥，2004，26(11):897-900.

［11］陳華國(guó)，陳 慶，靳鳳云.HPLC法測(cè)定斷血流中斷血流皂苷的含量［J］.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院報(bào)，2006，28(3):62-63.

［12］昝麗霞.HPLC-ELSD測(cè)定斷血流中的斷血流皂苷A［J］.華西藥學(xué)志，2007，22(6):677-678.