響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子有效成分的提取工藝

常星潔， 劉漢清， 鄒建榮， 劉志輝， 王 寧， 賈 媛， 嚴(yán) 冬*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046;2.南京藥業(yè)股份有限公司，江蘇南京 210004;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)一附院，江蘇南京 210036)

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞Ligustrum lucidumAit的成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效，用于肝腎陰虛、頭昏目眩、耳鳴、腰膝疲軟、須發(fā)早白等癥。女貞子有效成分之一齊墩果酸為脂溶性極強(qiáng)的三萜類成分，國(guó)內(nèi)外對(duì)其化學(xué)性質(zhì)和藥理作用進(jìn)行了深入而系統(tǒng)的研究［1］。而女貞子作為傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，一般采取水煎法服用，其水溶性有效成分亦不容忽視。研究表明，女貞子中的環(huán)烯醚萜類成分具有保肝利膽、抗肝纖維化、抗菌消炎、抗腫瘤、降血脂、降血糖、降低血液黏度、增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［2-3］。本研究以環(huán)烯醚萜類成分中含有量較高的特女貞苷和三萜類成分齊墩果酸為考察指標(biāo)，進(jìn)行女貞子回流提取工藝的研究，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面法，研究各因素對(duì)女貞子有效成分得率的影響。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀:G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司);電子分析天平(BP-211D型，德國(guó)賽多利斯公司);DP-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精弘實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

女貞子飲片購(gòu)自江蘇省醫(yī)藥公司，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院主任中藥師周琴妹鑒定為女貞子酒制品。齊墩果酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，定量測(cè)定用，批號(hào):0709-9803)，特女貞苷對(duì)照品(購(gòu)自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，定量測(cè)定用，批號(hào):ZL20100928TNZG)。測(cè)定用甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 特女貞苷定量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件［4］Hedera C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(40∶60);柱溫30 ℃;體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm，進(jìn)樣量5 μL。HPLC 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 特女貞苷對(duì)照品(A)和女貞子供試品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of specnuezhenide control and Ligustri lucidi Fructus 1.特女貞苷 1.specnuezhenide

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取特女貞苷10.26 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為406.4 μg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取該貯備液一定量，甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為40.64、81.28、121.92、203.20、243.84、325.12 μg/mL 的一系列對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，特女貞苷在40.64～325.12 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=6.292 4X+3.585 9，r=0.999 5。

2.1.3 供試品溶液制備與測(cè)定 精密吸取女貞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)后，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算。

2.2 齊墩果酸定量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件［5-6］sunfire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(90∶10);柱溫30℃;體積流量0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm。HPLC圖譜見(jiàn)圖2。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.45 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為418.0 μg/mL對(duì)照品貯備液。取該貯備液一定量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為8.36、16.72、41.80、83.60、104.50 μg/mL 的一系列對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。，8.36～104.50 g/mL面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=4.568 7X-1.063 5，r=0.999 8。

圖2 齊墩果酸對(duì)照品(A)和女貞子供試品(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of oleanolic acid control and Ligustri lucidi Fructus 1.齊墩果酸 1.oleanolic acid

2.2.3 供試品溶液制備與測(cè)定 精密吸取女貞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)后得供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算。

2.3 提取因素和相關(guān)水平的選擇

2.3.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，分別以水、30%、50%、70%、95%乙醇為溶劑，10倍量回流提取兩次，每次1 h。合并提取液，按定量測(cè)定方法制備供試品，測(cè)定特女貞苷、齊墩果酸，結(jié)果如圖3(n=3)。

圖3 不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)女貞子有效成分提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

如圖所示，以水為溶劑，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極低，提取液中幾乎無(wú)法檢出;以95%乙醇為溶劑，雖然齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，但特女貞苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而下降;而以50%、70%乙醇為溶劑對(duì)2個(gè)指標(biāo)值均能達(dá)到較好的提取效果，所以選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下限為50%，上限為70%。

2.3.2 提取時(shí)間范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，以10倍量60%乙醇提取2次，時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2 h，合并提取液，按定量測(cè)定方法制備供試品，測(cè)定特女貞苷、齊墩果酸，結(jié)果如圖4(n=3)?？芍崛? h后，二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，考慮到多因素交互作用的影響，提取時(shí)間范圍定為0.5～1.5 h。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)女貞子有效成分提取效果的影響Fig.4 Effect of extracting time on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

圖5 不同料液比對(duì)女貞子有效成分提取效果的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

2.3.3 溶劑倍量范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，分別加入4倍量、7倍量、10倍量、14倍量60%乙醇提取2次，每次1 h，合并提取液，按定量測(cè)定方法制備供試品，測(cè)定特女貞苷、齊墩果酸，結(jié)果如圖5(n=3)，可知10倍溶劑時(shí)提取量較高，大于10倍增加不顯著?？紤]到生產(chǎn)成本，溶劑倍量范圍定為8～12倍。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)［7-9］

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、溶劑倍量(X2)和提取時(shí)間(X3)為自變量，每個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼(表1)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。提取次數(shù)定為2次。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平的編碼Tab.1 Factor-levels and coding for Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型擬合 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert7.1.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值Y分別對(duì)各因素X(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，回歸方程為:Y=0.86+0.086X1+ 0.038X2+ 0.16X3+ 0.05X1X2-0.021X1X3+5.834E-003X2X3-0.08X12R2=0.984 4，Adj-R2=0.964 3。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由方差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)選擇區(qū)域范圍內(nèi)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)特女貞苷和齊墩果酸含，有量有極顯著影響，溶劑倍量、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溶劑倍量的交互作用對(duì)其有顯著影響?；貧w方程失擬檢驗(yàn)不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。擬合檢驗(yàn)極顯著，表明該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了特女貞苷和齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溶劑倍量和提取時(shí)間的關(guān)系，所得回歸方程能較好的預(yù)測(cè)女貞子有效成分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。由回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合評(píng)分最大預(yù)測(cè)值為1.04，最優(yōu)條件為67.2%乙醇、溶劑量12倍、提取時(shí)間1.5 h。

表3 女貞子提取工藝條件響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance with regression model on extraction conditions of constituents in Ligustri lucidi Fructus with RSM

2.4.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)選出的工藝條件，提取女貞子3份(每份100 g)，進(jìn)行工藝驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)表4。二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差率=(1.04-0.95)/1.04×100%=8.7%，說(shuō)明二項(xiàng)式擬合效果良好，可信度高。特女貞苷和齊墩果酸的轉(zhuǎn)移率分別達(dá)到96.96%和97.3%(轉(zhuǎn)移率=提取液中特女貞苷或齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/飲片中特女貞苷或齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%)，說(shuō)明優(yōu)選出的工藝提取效率高。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)Tab.4 Results of verification test(n=3)

3 討論

女貞子內(nèi)果皮質(zhì)地堅(jiān)硬，有效成分不易溶出，比較了飲片、壓扁整粒和10目粉末提取液中特女貞苷和齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，飲片中特女貞苷和齊墩果酸轉(zhuǎn)移率只能達(dá)到25.14%和23.60%。壓扁后內(nèi)果皮破裂，有效成分幾乎可以提取完全，轉(zhuǎn)移率和10目粉末無(wú)顯著差異。

曾嘗試用梯度洗脫同時(shí)測(cè)定特女貞苷和齊墩果酸，但梯度洗脫下齊墩果酸未能與其同分異構(gòu)體熊果酸分開(kāi)。故采取一次提取分2次進(jìn)樣的方法，峰形好，分離度達(dá)到要求，操作也較為方便。

女貞子的提取工藝多以齊墩果酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而以特女貞苷和齊墩果酸為綜合指標(biāo)對(duì)女貞子提取工藝的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法，通過(guò)非線性模型擬合得出最優(yōu)提取條件，避免了傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化法的不足，具有實(shí)驗(yàn)精度高、模型預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)。

［1］田麗婷，馬 龍，堵年生.齊墩果酸的藥理作用研究概況［J］.中國(guó)中藥雜志，2002，27(12):884-886.

［2］程 敏，胡正海.女貞子的生物學(xué)和化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中草藥，2010，41(7):1219-1221.

［3］羅玲英，趙 益，吳德智，等.含女貞子中成藥的劑型與工藝分析［J］.中國(guó)藥房，2010，21(23):2199-2200.

［4］中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:43.

［5］石力夫，蔡 溱，吳廣通，等.不同產(chǎn)地女貞子中水溶性活性成分及齊墩果酸的反相高效液相色譜分析［J］.中國(guó)中藥雜志，1998，23(2):77-79.

［6］相延英，楊 光.常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(5):316-317.

［7］田寶成，賈昌平，楊軍濤，等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究［J］.中成藥，2010，32(3):389-392.

［8］盧時(shí)勇，錢(qián)俊青，鄒小明.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取白術(shù)有效成分的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(7):549-551.

［9］楊 濤，盛歡歡，李 巖，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮提取工藝［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46( 3) : 208-213.