葉下珠總黃酮的半仿生提取工藝

藍峻峰，謝濟運

(柳州師范高等專科學?；瘜W與生命科學系，廣西柳州545004)

草藥葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)為大戟科植物的全草，又稱珍珠草、落地油柑、葉后珠、關門草等，具有平肝清熱、利水解毒之效，常用于治療腸炎、肝炎等炎癥及痢疾、尿路感染、無名腫痛等［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，葉下珠具有抗乙肝病毒和保肝、護肝作用［3］。黃酮類化合物分子由具兩個酚羥基的苯環(huán)通過居于中央位置的三碳原子相互連接而成，其分子結(jié)構中常連接有甲基、甲氧基及酚羥基、異戊烯基等還原基團，因此黃酮類化合物具有效清除人體內(nèi)的氧自由基功效，是一種常見的強抗氧劑。黃酮類化合物的生理活性作用較為廣泛，除具有對心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常的保護作用外，還具有鎮(zhèn)痛、抗自由基和抗腫瘤等作用［4］。鑒定研究表明，葉下珠植物中含有黃酮類化合物［5］，經(jīng)體外滅活HBV抗原作用實驗證明總黃酮為其抗病毒有效成分之一［6］。

半仿生提取法是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，為經(jīng)人類消化道給藥的中藥及其復方藥劑創(chuàng)立的一種提取新技術［7］，該法模仿口服藥物在人體胃腸道中的轉(zhuǎn)運過程，采用選定pH值的酸性和堿性水依次提取得到活性混合物。目前，葉下珠成分提取工藝主要以傳統(tǒng)有機溶劑提取為主［8］，這些方法提取有機溶劑殘留量大，副作用高，且提取效率低，成本高。本研究運用半仿生法原理，用特定pH的水溶液為溶劑，提取葉下珠黃酮，并用正交實驗優(yōu)化其提取工藝。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料及試劑葉下珠草藥，購于廣西柳州市中藥材市場，經(jīng)覃逸明博士鑒定為大戟科葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)全草。蘆丁對照品(2010-A0103，純度＞98%)，購于中國成都曼思特生物科技有限公司;實驗用水為蒸餾水，由實驗室自制;氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉及鹽酸等均為分析純試劑。

1.2 儀器及設備UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計，購于上海尤尼科儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購于鞏義市予華儀器廠;pHS-3C型精密酸度計，購自上海雷磁儀器廠;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵，由河南鞏義市英山谷予華儀器廠提供;YJ501型超級恒溫器，由上海躍進醫(yī)療器械廠提供;電子天平，由梅特勒-托利多儀器廠提供;遠紅外快速恒溫干燥箱，購自上海躍進醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備稱取蘆丁對照品32 mg，用70%乙醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，繼續(xù)用乙醇溶液稀釋、定容，得質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL蘆丁對照品貯備液。

2.2 標準曲線的繪制及回歸方程的建立實驗選用蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系吸光法［9-11］制作黃酮測定標準曲線。移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的上述2.1項蘆丁對照品貯備液分別置于6只量瓶中，加入NaNO2溶液還原6 min，隨后加入Al(NO3)3溶液絡合，再加入NaOH溶液5 mL，用乙醇溶液稀釋、定容，搖勻、顯色10 min后，于波長為510 nm處，以試劑空白作為參比，用紫外-可見分光光度計分別測定上述溶液的吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(C)，以吸光度值為橫坐標(A)，制作標準曲線，得回歸方程為:C=93.889A－0.360 3，相關系數(shù)r=0.999 8，曲線中黃酮質(zhì)量濃度線性范圍為0～64 μg/mL。

2.3 半仿生提取

2.3.1 提取溶劑的制備根據(jù)仿生學原理，人體消化道(胃、小腸、大腸)體液酸度pH分別為2.0、7.5、8.3［12］，因此，實驗中用HCl和Ca(OH)2飽和溶液將提取溶劑pH分別調(diào)為2.0、7.5、8.3，備用。

2.3.2 樣品的處理及制備取葉下珠全草經(jīng)粉碎、過篩(60目)后，稱取20.00 g于圓底燒瓶中，在一定條件先用pH 2.0的提取劑提取，冷卻后過濾，收集濾液，所得濾渣分別再用pH 7.5、8.3的提取溶劑各重復提取一次，冷卻、過濾，合并提取所得濾液，經(jīng)減壓濃縮得葉下珠提取液。提取液中總黃酮按2.4項的方法測定。

2.4 黃酮的測定吸取一定量葉下珠提取液于25 mL量瓶中，按上述2.2項黃酮對照品質(zhì)量濃度的測定方法依次加入相應的溶液后測定其吸光度，并計算總黃酮提取得率。

2.5 正交實驗設計在查閱文獻的基礎上，選取提取溫度、提取時間、料液比等三因素，每個因素3個水平進行實驗，選用L9(34)正交表進行實驗設計優(yōu)選半仿生法提取工藝條件。實驗因素、水平安排如表1。每個實驗分別在pH 2.0、7.5、8.3的溶劑中提取一次，合并濾液后測定黃酮。

表1 正交實驗因素水平表

2.6 驗證實驗依據(jù)正交實驗結(jié)果，按2.3.2項樣品處理及制備的方法，在最優(yōu)工藝條件下提取葉下珠總黃酮，平行實驗3次。

3 結(jié)果及分析

3.1 正交實驗結(jié)果及直觀分析根據(jù)實驗安排，提取葉下珠總黃酮的正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果及分析表

從表2中極差R的大小可看出，在實驗考察的三個因素中，對黃酮提取得率影響的主次關系為:A(提取溫度)＞C(料液比)＞B(提取時間);通過比較各因素的不同水平的k值，可得半仿生法提取葉下珠黃酮最佳工藝為A3B1C2，即提取溫度85℃，提取時間1.5 h，料液比1∶20。

3.2 正交實驗結(jié)果的方差分析實驗的方差分析結(jié)果見表3。

表3 實驗結(jié)果方差分析表

從表3中可以看出，考察的實驗因素中，在考察的因素水平范圍內(nèi)，溫度對葉下珠黃酮的提取得率的影響顯著，料液比對葉下珠黃酮的提取得率有一定的影響，時間對葉下珠黃酮的提取得率的影響不顯著。

3.3 驗證實驗結(jié)果利用正交實驗的最佳工藝條件，即提取溫度85℃，提取時間1.5 h，料液比1∶20做驗證實驗，平行3次，結(jié)果見表4。

表4 驗證實驗結(jié)果表

3次驗證實驗平均提取得率為1.505%，RSD=0.433%，結(jié)果為所有實驗中最高的。該實驗結(jié)果表明，半仿生提取法用于葉下珠總黃酮的提取，黃酮得率高，方法可靠，結(jié)果準確。

4 結(jié)論

4.1 運用半仿生法提取葉下珠總黃酮時，用pH分別為2.0、7.5、8.3的水溶液為提取溶劑各提取一次，用正交實驗考察提取溫度、提取時間和提取料液比對提取得率的影響，結(jié)果表明:在考察的因素水平范圍內(nèi)，溫度對葉下珠黃酮提取得率影響顯著，時間對葉下珠黃酮提取得率影響不顯著，料液比對黃酮得率有一定的影響。各因素對黃酮提取得率的影響大小次序為:提取溫度＞料液比＞提取時間。葉下珠總黃酮的最佳提取工藝條件為:提取溫度85℃，料液比1∶20，提取時間1.5 h。用此工藝提取葉下珠黃酮提取得率較高，可達1.505%，優(yōu)于文獻顯示的傳統(tǒng)方法提取效果［13］。

4.2 與傳統(tǒng)的提取方法比較，半仿生提取法模擬人體口服給藥過程，以不同pH的水溶液為提取溶劑，不使用有機溶劑，減少對環(huán)境及生產(chǎn)操作人員的身體傷害，對環(huán)境友好，易于實現(xiàn)綠色化生產(chǎn)，且提取得率較高，利于降低生產(chǎn)成本。

［1］江蘇新醫(yī)學院編.中藥大辭典:下冊［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1997:1496.

［2］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編:上冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:263.

［3］范適，李蘭嵐，饒力群，等.抗乙肝植物藥葉下珠化學成分和藥理作用研究進展［J］.南華大學學報:自然科學版，2006，20(2):83-87.

［4］黃河勝，馬傳庚，陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2000，25(10):589-592.

［5］張?zhí)m珍，郭亞健，涂光忠，等.葉下珠化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2000，25(10):615-617.

［6］賀浪沖，岐林，呂居嫻，等.陜西葉下珠藥用開發(fā)研究:Ⅲ提取物體外滅活HBV抗原作用［J］.西北藥學雜志，1996，11(1):11.

［7］孫秀梅，張兆旺.建立中藥用“半仿生提取”研究的技術平臺［J］.中成藥，2006，28(4):614-616.

［8］曾凡芝，藍峻峰.葉下珠提取方法的研究概況［J］.柳州師專學報，2009，24(4):117-121.

［9］藍峻峰，謝濟運.果膠酶法提取葉下珠黃酮的工藝優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(21):11128-11129.

［10］藍峻峰，賴紅芳.響應面法優(yōu)化葉下珠黃酮提取工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(20):12118-12120.

［11］耿紅梅.歐亞旋覆花中黃酮類化合物的研究［D］.石家莊:河北醫(yī)科大學，2007.

［12］王蕙，付燕，郎久義，等.酶法及半仿生法提取銀杏黃酮的工藝研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2009，11(2):146-148.

［13］馬燮，李敏，楊虎，等.正交試驗優(yōu)選葉下珠中黃酮類化合物的提取工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(11):117-119.