鴨疫里氏桿菌病診斷方法研究進(jìn)展

么乃全，高云航，徐鳳宇，張 敏，王全凱

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118;2．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

鴨疫里氏桿菌病俗稱雛鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起1～8周齡雛鴨的一種急性或慢性傳染病，可導(dǎo)致2～3周齡雛鴨大批發(fā)病、死亡，生長發(fā)育嚴(yán)重受阻。在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎都有流行，已成為影響?zhàn)B鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病。該病也可發(fā)生于其它禽類如鵝、火雞等，從雞、雉、鵪鶉、鴿子及野生水禽也分到該菌［1］。Bocklisch等還證實了該菌可導(dǎo)致鴕鳥死亡，并從其體內(nèi)分離到 RA［2］。感染 RA病鴨主要臨床表現(xiàn)為精神萎靡、食欲下降、歪頸、跛行、眼鼻流出漿液性或粘液性分泌物，腹瀉，糞便呈黃綠色，病鴨出現(xiàn)痙攣、角弓反張等神經(jīng)癥狀。病理變化主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎等。在臨床上常與大腸桿菌混合感染，且與大腸桿菌和沙門菌的剖檢變化非常相似，因此確診需進(jìn)行實驗室診斷。目前RA的診斷方法主要包括常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定、免疫血清學(xué)技術(shù)及各種PCR方法等。本文將對其研究進(jìn)展進(jìn)行簡要概述。

1 細(xì)菌分離鑒定

病料可采集發(fā)病鴨的腦、肝臟及心血，接種于含5%～10%犢?；蛲醚宓囊鹊鞍纂舜蠖弓傊?TSA)或馬丁瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，置于5%～10%的CO2培養(yǎng)箱或蠟燭缸中，37℃培養(yǎng)12～24 h，菌落形態(tài)為圓形光滑、邊緣整齊、半透明，直徑約1 mm，在TSA培養(yǎng)基上為露滴樣稍帶綠色熒光。對疑似菌落進(jìn)行染色，鏡檢可見革蘭染色陰性、散在的短桿菌，少數(shù)呈短鏈狀排列，美蘭染色則呈兩極濃染。該菌的生化特性不活潑，僅發(fā)酵少數(shù)糖類，利用其不發(fā)酵葡萄糖和乳糖的特點，可與巴氏桿菌相鑒別。若與大腸桿菌與沙門菌相鑒別，可將采集的病料或疑似菌落接種于麥康凱瓊脂平板，RA不生長，大腸桿菌形成紅色菌落，而沙門菌則形成無色菌落。

2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

2．1 瓊脂擴(kuò)散試驗 將純培養(yǎng)的疑似RA經(jīng)水浴煮沸1 h，4000 r/min離心30 min，取上清液作為待檢抗原，將其與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀線即為陽性反應(yīng)。也可用已經(jīng)鑒定的RA制備抗原檢測血清中的特異性抗體，但由于鴨疫里氏桿菌的血清型較多，各血清型間很少存在交叉反應(yīng)，要采用該方法進(jìn)行檢測需有多種血清型的陽性血清。目前，該方法主要用于RA血清型的鑒定，需注意的是瓊脂擴(kuò)散試驗敏感性稍低，檢測不出凝集價低于1∶20的血清樣品，若抗體效價過低，同型的抗原抗體反應(yīng)較弱易造成假陰性結(jié)果［3］。

2．2 凝集試驗 凝集試驗分為玻片凝集試驗和試管凝集試驗兩種。用陽性血清通過玻片和試管凝集試驗可以對同型細(xì)菌進(jìn)行快速鑒定，并能掌握所檢測病原菌的血清型。其中玻片凝集容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，適用于大量菌株快速篩選，要準(zhǔn)確定型還須依賴于試管凝集試驗［4］。試管凝集試驗可更準(zhǔn)確的進(jìn)行血清型鑒定、血清流行病學(xué)調(diào)查以及抗體效價檢測。雖然也易檢測到交叉反應(yīng)，但可以通過參照菌及凝集效價的高低來定型。當(dāng)分離株與參考株的效價相差3個或以上滴度時，可判斷為異型或至少可肯定它們存在抗原差異;若分離株與參考菌的效價相等或相差1個滴度時，一般可認(rèn)為是同型，但也不能排除存在抗原差異的可能［3］。

2．3 間接免疫酶組織化學(xué)法 劉維平、孟瓊?cè)A等［5－6］先后用血清1型RA作為抗原，免疫兔制備兔抗RA的IgG，建立了檢測雛鴨和雛鵝感染鴨疫里氏桿菌的間接免疫酶組織化學(xué)法(Indirect Immuno Histo Chemical Technique)，可用于現(xiàn)場鴨疫里氏桿菌病的快速診斷，通過優(yōu)化各反應(yīng)條件使該方法檢測臨床可疑病例的敏感性高于細(xì)菌分離鑒定，該方法還可對抗原進(jìn)行精確定位，適用于鴨疫里氏桿菌病致病機(jī)制的研究。免疫組織酶法相比于免疫熒光技術(shù)最大的優(yōu)點是其不需要熒光顯微鏡?；鶎訂挝豢蓪⒅谱鞯臉?biāo)本片長期保存，只需光學(xué)顯微鏡即可觀察。

2．4 免疫酶檢測技術(shù) 目前，國內(nèi)外已報道多種檢測RA抗體的ELISA方法。RA全菌體、菌體裂解物和脂多糖等均被用作包被抗原建立間接ELSIA方法，具有較好的特異性和敏感性，但只限于同種血清型菌株抗體的檢測，應(yīng)用有很大的局限性。外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OmpA)是RA菌體主要的表面抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，已經(jīng)廣泛被用做檢測RA抗體的抗原。孫龔、程龍飛等［7－8］分別以血清1型和2型RA的OmpA重組蛋白建立了間接ELSIA檢測方法，并應(yīng)用于同型血清抗體的檢測。同時眾多研究還證明OmpA為各血清型菌株所共有，且經(jīng)免疫印跡證明能夠與各血清型菌株抗體均發(fā)生反應(yīng)，足以說明該蛋白可用于多種血清型抗體的檢測。但目前尚未見到以O(shè)mpA蛋白為抗原建立ELSIA方法檢測多血清型抗體的研究報道。其實際應(yīng)用效果還有待于進(jìn)一步驗證。Huang等［9］以一種可能為新的RA表面抗原P45編碼的41 kDa重組蛋白rP45N’為抗原建立了ELISA方法，可成功檢測到血清型 1、10、15、9和 ATCC 11845菌株免疫鴨的P45抗體。同時還發(fā)現(xiàn)編碼p45的DNA序列除了血清型10外的1～19型中均存在。辜新貴［10］則從鴨疫里氏桿菌1型基因組文庫中篩選出一種“保守假定蛋白P25”，序列分析表明 P25 是 RA1、2、5、8、10 血清型所共有的抗原蛋白，并利用P25表達(dá)蛋白為抗原建立了敏感性高和重復(fù)性好的間接ELISA檢測方法，能特異性檢測出RA1、2、5、8、10 血清型的感染。以上研究表明 P45和P25蛋白可作為抗原檢測各種血清型RA抗體。

方欽［11］通過原核重組表達(dá)及親和純化的協(xié)同溶血素CAM融合蛋白，建立了間接ELISA方法。經(jīng)驗證該方法能檢測感染鴨血清中抗體，而檢測滅活苗免疫鴨血清抗體為陰性。說明以CAM融合蛋白為抗原建立的ELISA檢測方法能夠區(qū)分自然感染和滅活疫苗免疫，可用于RA感染診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

2．5 免疫親和傳感器檢測技術(shù) 免疫親和傳感器檢測技術(shù)是生物傳感器檢測技術(shù)的一種，是指固定有抗原或抗體生物組件與待測物(抗體或抗原)發(fā)生親和性結(jié)合時，造成生物分子形狀改變或引起諸如電荷、厚度、質(zhì)量、熱量或光學(xué)等物理量的變化。這些變化經(jīng)物理或化學(xué)換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，便可檢出待測物中抗原或抗體的濃度［12］。Chenghong Huang等［13］將抗鴨疫里氏桿菌的卵黃抗體IgY固定于改良的化學(xué)物質(zhì)表面作為傳感層，通過橢偏光學(xué)生物傳感器(Biosensor based on imaging ellipsometry，BIE)對傳感層捕獲的RA抗原進(jìn)行定量檢測，可以檢測至少5．2×103CFU/mL的RA。同時還發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠區(qū)分1、2、4、14等幾種血清型的RA菌株。該方法具有快速、簡單、高靈敏度和低成本的優(yōu)點，與其他方法相比具有不可比擬的優(yōu)勢，可用于RA病原的檢測及血清型的鑒定。

3 PCR檢測技術(shù)

3．1 普通PCR檢測 曲豐發(fā)等［14］針對16S rDNA基因設(shè)計一對特異性引物，分別以基因組DNA和菌落提取液為模板對1～19型RA參考菌株及26個國內(nèi)分離株進(jìn)行擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出654 bp大小的片段。而大腸桿菌、鴨沙門菌和多殺性巴氏桿菌擴(kuò)增結(jié)果為陰性，基因組DNA最小檢出量為50 pg，說明所建立的方法具有較高的特異性和敏感性。孫?等［15］則根據(jù)已發(fā)表的鴨疫里氏桿菌的外膜蛋白A的基因序列設(shè)計1對引物，對7株不同血清型鴨疫里氏桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出與預(yù)計大小一致的目的片段，敏感性可達(dá)到8．6 pg，而多殺性巴氏桿菌、沙門菌、大腸桿菌和金色葡萄球菌均未擴(kuò)增出預(yù)計大小的片段。Kardos等［16］根據(jù)一段700 bp大小的腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)設(shè)計引物建立了能夠特異性檢測RA的ERIC－PCR方法，臨床分離的72株RA的檢測結(jié)果與生化鑒定結(jié)果相一致，而對支原體、巴氏桿菌、沙門菌等檢測結(jié)果為陰性，可用于RA的快速鑒定。PCR檢測方法特異性高、敏感性強(qiáng)，可以避免血清型的限制，能夠?qū)崿F(xiàn)對RA的快速檢測。

3．2 多重PCR檢測 譚宗華［17］等對鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，根據(jù)二者16S rRNA相同保守區(qū)設(shè)計1條公用引物，根據(jù)各自可變區(qū)設(shè)計了2條種特異性引物，建立了能快速準(zhǔn)確鑒別診斷鴨疫里默氏菌和大腸桿菌的雙重PCR方法。分別從各自的16S rRNA基因中擴(kuò)增出長度為342和718 bp的DNA片段。該方法能從肝組織懸液煮沸后的上清、細(xì)菌培養(yǎng)物或提取的細(xì)菌基因組DNA中快速擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，縮短了檢測時間。王春平［18］根據(jù)鴨疫里默氏菌和大腸桿菌的外膜蛋白A基因序列設(shè)計2對引物，建立了快速檢測2種疾病的多重PCR檢測方法。該法能直接以肝臟組織研磨后的濾液為模板分別擴(kuò)增出670、408 bp的特異性DNA片段，與常規(guī)PCR檢測方法的符合率達(dá)100%，且省去了細(xì)菌純培養(yǎng)和基因組提取等步驟，所需時間短，能達(dá)到快速診斷并鑒別兩種疾病的目的。Qinghai Hu根據(jù)RA的DnaB螺旋酶、大腸桿菌的堿性磷酸酶和沙門菌的侵襲蛋白基因作為目的基因建立了能同時檢測并區(qū)分三種細(xì)菌感染的多重PCR方法［19］，檢測限可達(dá)103CFU。其中RA的DnaB螺旋酶首次被用于檢測，序列分析表明該基因在RA不同血清型間同源性達(dá)98．1% ～100%，表明該方法可用于各種血清型RA的檢測。多重PCR方法在具備普通PCR敏感性和特異性的基礎(chǔ)上可以實現(xiàn)同時對多種病原進(jìn)行檢測，提高了檢測效率。

3．3 熒光定量 PCR檢測 馮金牛［20］等根據(jù) RA 16S rRNA基因的保守序列設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測RA的實時熒光定量PCR方法。該方法只對RA DNA有陽性擴(kuò)增信號，對大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門菌均無特異性反應(yīng)，具有高度特異性，敏感性比普通PCR高100倍。謝永平［21］等根據(jù)RA的外膜蛋白A基因保守序列設(shè)計引物和探針，建立了實時熒光定量PCR方法，對煮沸法提取人工感染鴨組織RA基因組進(jìn)行檢測，陽性檢出率為92%，比RA分離率高84%。同時利用該方法可快速檢測活鴨咽喉拭子和泄殖腔拭子，不需通過剖殺活鴨采集臟器檢測，為RA流行病學(xué)調(diào)查、感染早期診斷、種鴨引進(jìn)的隔離檢疫、市場檢疫、進(jìn)出口檢驗檢疫等提供了新的快速檢測途徑。熒光定量PCR不需電泳、染色等操作，省時且避免了環(huán)境的污染，還能對病原進(jìn)行定量分析，對進(jìn)一步研究RA致病機(jī)制具有重要意義。

3．4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(LAMP)是 Notomi［22］開發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，針對小于300bp基因序列設(shè)計4種特異性引物，利用BST DNA聚合酶在水浴加熱恒溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地擴(kuò)增靶序列，不需PCR儀等設(shè)備，檢測結(jié)果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成即可判斷。Fuying Zheng等［23］建立了檢測RA的LAMP方法。根據(jù)RA外膜蛋白A 60～239 bp之間的基因序列設(shè)計了6條引物，該法成功地從參考菌株、分離菌株及感染鴨腦檢測出該基因，敏感性比普通PCR高出10倍。陳紅梅［24］于2010年根據(jù)RA外膜蛋白A基因序列中300 bp的片段為模板設(shè)計了一套引物，也成功建立了環(huán)狀等溫介導(dǎo)PCR法。通過條件優(yōu)化，顯示了很高的特異性，DNA模板的靈敏度可達(dá)800 fg。楊金龍［25］根據(jù)鴨疫里氏桿菌16S rRNA保守區(qū)的六個特異區(qū)域設(shè)計了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，開發(fā)出鴨疫里默氏桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒，可以特異地區(qū)分鴨疫里氏桿菌與大腸桿菌及沙門菌，具有高度特異性，已申請國家專利。該方法對引物設(shè)計要求較高，采用熒光染料判定結(jié)果時易出現(xiàn)開蓋污染的問題，但操作簡單，對實驗條件要求不高，非常適合基層RA的診斷。

隨著各種新技術(shù)的應(yīng)用，鴨疫里氏桿菌病診斷方法也不斷被開發(fā)。PCR診斷方法不僅具有很高的特異性和敏感性，且方便、快捷，還能擺脫RA不同血清型的限制，將在鴨疫里氏桿菌病診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。常規(guī)血清學(xué)檢測方法除了能用于疾病檢測外還可以用于疫苗質(zhì)量評價及指導(dǎo)制定免疫程序。OmpA、P45及P25等蛋白的應(yīng)用已經(jīng)在一定程度上解決了RA血清型間交叉反應(yīng)小的問題，且隨著對RA免疫和致病機(jī)制的深入研究，相信會有更多具有交叉反應(yīng)性或保護(hù)性的蛋白被開發(fā)，從而為鴨疫里氏桿菌病的診斷和免疫防控提供新的方法和思路。

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