利用RP－HPLC指紋圖譜技術(shù)評(píng)價(jià)中草藥添加劑的質(zhì)量研究

付 媛，張雪娟，石團(tuán)員，盧福莊

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

《中國(guó)藥典》2010年版中收載有測(cè)定單味中藥陳皮、黃芩、甘草等的HPLC方法［1］，但是同時(shí)測(cè)定復(fù)方制劑中甘草苷、橙皮苷、黃芩苷的方法尚未見報(bào)道。為更好的控制復(fù)中草藥添加劑的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法對(duì)我室研制的防控豬高熱綜合征中草藥添加劑進(jìn)行分析，獲得中草藥添加劑的指紋圖譜，并對(duì)其有效成分甘草苷、橙皮苷、黃芩苷進(jìn)行定量研究，作為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的主要方法。

1 儀器與試劑

1．1 儀器 Agilent 1200液相色譜儀含紫外檢測(cè)器，四元泵，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，層析柱為Agilent HC － C18色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，預(yù)柱為Agilent HC－C18High performance Reliance Cartridge保護(hù)柱。DL－720A超聲波清洗器為上海之信儀器有限公司產(chǎn)品。

1．2 藥品與試劑 防控豬高熱綜合征中草藥添加劑是由陳皮、黃芩、甘草等10多種中草藥組成，由本研究室研發(fā)。黃芩，甘草，陳皮等組成中草藥添加劑的藥材均購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司參茸藥材分公司，為中藥飲片，質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》2010版要求。中草藥飼料添加劑由10多種中草藥各自預(yù)粉碎，過40目篩，再按處方比例混合而成。共購(gòu)買單味藥材2批次，1～9批次樣品由第一次購(gòu)買的藥材制成，10～12批次樣品由第二次購(gòu)買的藥材制成。對(duì)照品黃苓苷(批號(hào):10121531，純度大于98%)、橙皮苷(批號(hào):10061831，純度大于97%)、甘草苷(批號(hào):10123131，純度大于98%)均購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司。乙腈為Scharlau公司產(chǎn)品，HPLC色譜純。水為蒸餾水。其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2．1 分析條件 色譜柱:Agilent HC－C18色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)和保護(hù)柱，柱溫25 ℃，流動(dòng)相由 A相和 B相 組成，A相為乙腈，B相為0．2%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10μL。洗脫程序見表1，每次進(jìn)樣間隔時(shí)間10 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2．2 溶液的制備

2．2．1 對(duì)照品溶液的制備 分別取橙皮苷、黃苓苷、甘草苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加適量甲醇溶解，制成400μg/mL的溶液。各取高濃度標(biāo)準(zhǔn)液用甲醇定量稀釋成含橙皮苷20μg/mL、黃芩苷20 μg/mL、甘草苷40μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2．2．2 供試品溶液的制備 取陳皮、黃芩、甘草藥材和中草藥添加劑粉末各0．1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，超聲提取15 min，用甲醇補(bǔ)足體積，浸泡12 h，搖勻，微孔濾膜(0．45 μm)濾過，即得。

2．3 方法學(xué)考察

2．3．1 對(duì)照品色譜測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品溶液(橙皮苷20μg/mL、黃芩苷20μg/mL、甘草苷40 μg/mL)10μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 混合對(duì)照品RP－HPLC色譜圖

2．3．2 精密度試驗(yàn) 取中草藥添加劑0．1 g，精密稱定，按2．2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次結(jié)果表明，各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積的 RSD 分別為 0．06% ～0．12% 和 1．00% ～2．23%，符合指紋圖譜要求。

2．3．3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的中草藥添加劑樣品0．1 g，分別同法制備樣品6 份，按2．2．2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積均無明顯變化，其RSD分別為0．03% ～0．09% 和1．82% ～2．27%，符合指紋圖譜要求。

2．3．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批中草藥添加劑供試品溶液，分別在1、2、3、4、5、7 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積無明顯變化，其RSD 分別在0．01% ～0．03%和0．71% ～1．58%之間，符合指紋圖譜要求，表明供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．3．5 延遲時(shí)間色譜記錄 以乙腈－0．2%磷酸溶液(95∶5)為流動(dòng)相對(duì)中草藥添加劑樣品延長(zhǎng)測(cè)試時(shí)間至2 h，記錄色譜圖，無滯后峰出現(xiàn)。

2．3．6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的中草藥添加劑0．1 g，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，分別精密加入一定量的甘草苷、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品，重復(fù)操作6份，按上述方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率分別為(99．56 ±3．33)%、(98．72 ±2．62)%、(103．53 ±2．27)%，RSD 分別為3．34%、2．66%、2．19%，表明方法的回收率良好。

2．4 中草藥添加劑RP－HPLC指紋圖譜建立及分析

黃芩、甘草、陳皮和12批次中草藥添加劑0．1 g，按2．2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)色譜分析結(jié)果，可分離出多個(gè)特征峰，從中選取15個(gè)穩(wěn)定的特征峰(圖2D)，12批次15個(gè)色譜峰的保留時(shí)間見表2。

表2 主要色譜峰的保留時(shí)間(n=12)

15個(gè)共有特征峰總面積占總峰面積90%以上，經(jīng)與對(duì)照品的色譜圖(圖1)比較，根據(jù)保留時(shí)間定性確定3號(hào)峰為甘草苷，5號(hào)峰為橙皮苷，7號(hào)峰為黃芩苷。黃芩(圖2A)、陳皮(圖2B)、甘草(圖2C)的色譜圖分析可知:3號(hào)峰為甘草特有，5號(hào)峰為陳皮特有，1、4、6、7、9、11、13、14、15 號(hào)峰均為黃芩的特有峰，2號(hào)峰為陳皮和甘草共有峰，8號(hào)峰為黃芩和陳皮共有峰。10號(hào)峰為甘草和黃芩共有峰，12號(hào)峰為甘草、黃芩和陳皮共有峰，但這兩個(gè)峰都以黃芩的成分為主。

圖2 樣品的RP－HPLC指紋圖譜

2．5 中草藥添加劑中橙皮苷、黃芩苷、甘草苷的含量測(cè)定

2．5．1 線性關(guān)系 取對(duì)照品橙皮苷、黃芩苷、甘草苷貯備液連續(xù)稀釋，陳皮苷和黃芩苷濃度分別為400、200、100、50、25、12．5、6．25 μg/mL，甘草苷的濃度為 400、200、100、50、25、12．5、6．25、3．125、1．563、0．78125 μg/mL 的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，以進(jìn)樣量(x，μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)橙皮苷、黃芩苷和甘草苷的峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，獲得曲線方程見表3。

表3 對(duì)照品的回歸方程(n＞7)

2．6．2 中草藥添加劑中定量組分的含量測(cè)定 測(cè)定12個(gè)批次中草藥添加劑中甘草苷、橙皮苷和黃芩苷特征峰的峰面積，計(jì)算中草藥添加劑中甘草苷、橙皮苷和黃芩苷含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中甘草苷、黃芩苷和陳皮苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=12)

3 討論和結(jié)論

防控豬高熱綜合征中草藥添加劑是由陳皮、黃芩、甘草等10多種中草藥組成，具有抗菌、抗病毒作用，由本研究室研發(fā)。在一些豬場(chǎng)應(yīng)用的試驗(yàn)表明，添加劑可以顯著提高豬瘟疫苗免疫后抗體的陽(yáng)性率，推測(cè)中草藥添加劑可能具有抵抗或消除上述病原對(duì)豬的免疫抑制作用，從而提高免疫的成功率，對(duì)豬高熱綜合征有較好的防控效果，并有提高增重和飼料轉(zhuǎn)化效率、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多重作用［2－3］。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4－7］，在相同的條件下分別采用甘草苷的最大吸收波長(zhǎng)276 nm，黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)280 nm，橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)284 nm對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在280 nm處可以同時(shí)檢測(cè)到橙皮苷、黃芩苷、甘草苷，各成分均達(dá)到基線分離，并且基線平穩(wěn)。故本研究選擇280nm作為指紋圖譜采集和有效成分定量分析的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究采用了甲醇－0．2%磷酸溶液和乙腈－0．2%磷酸溶液兩種流動(dòng)相，以相同的梯度洗脫進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在相同的積分條件下，采用甲醇－0．2%磷酸溶液系統(tǒng)，樣品主要的色譜峰的保留時(shí)間在40 min以后，檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，且基線不穩(wěn)定，噪聲影響大。而采用目前的乙腈－0．2%磷酸梯度洗脫，分離效果好，主要色譜峰都出現(xiàn)在25～50 min，并且重現(xiàn)性強(qiáng)，基線穩(wěn)定。所以流動(dòng)相選擇乙腈－0．2%磷酸溶液。

從獲得的對(duì)照?qǐng)D譜可以看出中草藥添加劑的特征峰主要出現(xiàn)在25～50 min內(nèi)，主要的共有峰中黃芩的主要成分為多數(shù)，包括黃芩苷的9個(gè)峰。其中黃芩苷的峰面積占總峰面積的30%，提示中草藥添加劑的甲醇制備供試品溶液的方法可以更有效的提純出黃芩的主要成分。

本研究的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本分析方法可靠，可以獲得穩(wěn)定的指紋圖譜，可以作為防控豬高熱綜合征中草藥添加劑的質(zhì)量控制的有效方法。

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