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    人臍帶間充質(zhì)干細胞于不同通電情況下在聚吡咯上生長情況的形態(tài)

    2012-01-25 21:16:20孫曉丹安沂華
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:梭形共培養(yǎng)單克隆

    張 涵,吳 昭,黃 華,孫曉丹,安沂華

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所,北京 100050;2.清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系,北京 100086)

    神經(jīng)系統(tǒng)作為生物體內(nèi)電活動最為活躍的部分之一,電磁場作用對其有著特別重要的意義(1),成為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的研究熱點之一。聚吡咯(PPy)是近年來新興的具有較好組織相容性的導(dǎo)電材料。臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)是近年來間充質(zhì)干細胞研究中的熱點,是未來干細胞應(yīng)用中的重要成員。然而,將hUC-MSC與PPy共培養(yǎng),對不同條件的電刺激對細胞形態(tài)和貼附的影響的研究還十分少見。本實驗將hUC-MSC與PPy共培養(yǎng),對細胞在不同通電情況下的形態(tài)學(xué)變化進行研究,對闡明由PPy介導(dǎo)的直接電刺激對hUC-MSC的影響提供初步依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料

    PPy由清華大學(xué)材料系提供

    試劑:αMEM(Hyclon公司),胎牛血清(Hyclon公司),無色低糖DMEM(Gibco公司),4%多聚甲醛(Sigma公司),0.25%胰酶(含0.02%EDTA) (Sigma公司);細胞流式檢測抗體(均為小鼠IgGl抗體):PE-CD29單克隆抗體,F(xiàn)ITC-CD44單克隆抗體,PE-CD54單克隆抗體,PE-CD 45單克隆抗體,F(xiàn)ITC-CD 106單克隆抗體,F(xiàn)ITC-CD14單克隆抗體,PE-CD34單克隆抗體,F(xiàn)ITC-HLA-DR單克隆抗體(美國BD BDIS公司);

    主要儀器:電極:銅鍍鋅電極;掃描電鏡(HITACHI TM-1000);FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest軟件(Becton Dickinson)

    1.2 hUC-MSC分離培養(yǎng)與鑒定

    選擇健康的正常孕周的剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦,經(jīng)其同意后,于手術(shù)后取臍帶約5~10 cm,無菌條件下去除其表面羊膜及臍帶內(nèi)血管,取Wharton’s Jelly,于生理鹽水中清洗3次后,剪成體積約1 cm3的小塊,置于含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中采用貼壁法進行培養(yǎng),每5~7 d進行傳代。收集第3~6代的細胞,利用倒置相差顯微鏡和流式細胞儀進行鑒定。

    1.3 PPy制備

    選用對甲基苯磺酸鈉(TsONa)為支持電解質(zhì),加入對甲基苯磺酸(TsOH)為添加劑,采用三電極電化學(xué)體系制備PPy薄膜。

    1.4 hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)及通電刺激

    選擇第 3~6代的hUC-MSC,制備成濃度為0.25×106/m L的細胞懸液,接種于面積為4 cm2的PPy表面,加入培養(yǎng)基5 m L,置于5%CO2、37℃環(huán)境內(nèi)共培養(yǎng)24 h,換入無血清無色低糖DMEM作為通電時的培養(yǎng)基后進行通電刺激,通電后換回原含血清αMEM培養(yǎng)基。

    1.5 實驗分組

    (1)對照組:將hUC-MSC置于蓋玻片上,在含有10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d

    (2)不加電組:將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)3 d

    (3)控制電壓組:將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)24 h后,施加電刺激,將場強控制為100 mV/mm,由于PPy上兩電極間距離為3.5 cm,因此控制電壓V= 3.5V,通電時間t=1 h/d,連續(xù)通電3 d。

    (4)控制電流組:將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)24 h后,施加電刺激,將電流控制為I=10mA,通電時間t=1 h/d,連續(xù)通電3 d。

    1.6 hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)后SEM檢測

    hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)并通電3 d后,室溫下置于4%多聚甲醛中固定4 h,生理鹽水沖洗,掃描電鏡觀察細胞在PPy表面貼附情況及細胞形態(tài)變化。

    1.7 hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)4d后,收集其培養(yǎng)基,光鏡下觀察是否仍有細胞懸浮。

    2 結(jié)果

    2.1 hUC-MSC鑒定

    光鏡下顯示第3~6代時,單個細胞多呈梭形類似于成纖維細胞形態(tài),折光性良好,細胞生長密度增加趨于融合時,呈現(xiàn)平行排列或典型魚群樣生長,均一性良好。采用流式細胞儀對第3~6代細胞進行檢測發(fā)現(xiàn)其不表達造血干細胞標記CD34、CD45、CD14、CD106和HLA-DR,而MSCs黏附分子和基質(zhì)細胞標記CD44、CD29、CD54均呈高表達(數(shù)據(jù)未顯示)。

    2.2 hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)后SEM觀察

    2.2.1 對照組

    hUC-MSC單獨培養(yǎng),電鏡下可見hUC-MSC在蓋玻片上貼附,細胞呈魚群樣或平行樣排列,絕大部分呈梭形,形態(tài)飽滿,邊緣清晰,部分細胞伸出細長偽足。(彩插2圖1)

    2.2.1 不加電組

    電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附,主要聚集貼附于局部地區(qū),其他地區(qū)基本未見有細胞分布。細胞基本呈長梭形,形態(tài)飽滿,邊緣較為清晰,可見細胞伸出細長偽足,細胞在密度較大的區(qū)域呈現(xiàn)平行排列生長。(彩插2圖2)

    2.2.2 控制電壓組

    電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附,主要聚集貼附于局部地區(qū),其他地區(qū)也有分布。細胞基本呈扁平狀,細胞間的分界不清,常匯合成片,在PPy表面突起較為明顯時,細胞可伸展為扁平薄片狀,部分細胞表面出現(xiàn)破損(彩插2圖3)。

    2.2.3 控制電流組

    電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附,總體較為均勻,在部分地區(qū)更為密集,其他地區(qū)稍少。細胞基本呈扁平狀,細胞間常匯合成片、分界不清。在細胞密度較大時局部有重疊增厚現(xiàn)象(彩插2圖4)。

    2.3 光鏡下觀察hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)4d后培養(yǎng)基

    光鏡下可見3個實驗組培養(yǎng)基中均有較多量細胞懸浮。將懸浮細胞離心后重新接種于培養(yǎng)瓶中,3~5 d后仍可出現(xiàn)典型梭形細胞呈魚群樣生長。

    3 討論

    神經(jīng)系統(tǒng)的電活動活躍,電刺激對其損傷修復(fù)具有明顯的影響。如何利用這個特性對神經(jīng)損傷進行修復(fù)是近年來相關(guān)研究的方向之一。

    hUC-MSC是近年來干細胞研究中的熱點,具有干細胞的基本特性即自我更新能力及多向分化潛能,目前認為,hUC-MSC可能通過“替代作用”和/或“營養(yǎng)作用”促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù),雖然其修復(fù)機制尚未明確,但已有多項研究證明這種修復(fù)作用是十分顯著的[2-4]。而且其分離提取不對產(chǎn)婦和新生兒造成額外損傷,并規(guī)避了有關(guān)的醫(yī)學(xué)倫理問題,體外培養(yǎng)方法較為簡便,因此成為未來干細胞臨床應(yīng)用的重點研究對象之一。聚吡咯本身即具有導(dǎo)電性能,容易制備,表面特性易于改變,且具有良好的組織相容性[5-7],可顯著降低星形膠質(zhì)細胞的黏附、聚集,減少膠質(zhì)瘢痕的形成[8],并可在外源性電場影響下促進粘附其上的神經(jīng)細胞的軸突有方向性地延伸[9]。本研究針對神經(jīng)組織的特點,采用聚吡咯作為支架,與hUC-MSC共培養(yǎng),對體外條件下不同通電情況對細胞的影響進行初步研究,可為將來將兩者結(jié)合修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供初步依據(jù)。

    研究結(jié)果顯示,電刺激對細胞形態(tài)學(xué)的影響主要體現(xiàn)在以下幾個方面:

    (1)PPy表面細胞分布

    hUC-MSC可在通電和不通電的情況下貼附于PPy表面,但貼附情況不盡相同。從對照組結(jié)果可見,普通培養(yǎng)條件下,在貼附條件適合的情況下,大部分細胞可均勻貼附于介質(zhì)表面。當細胞培養(yǎng)于PPy表面且不通電時,大部分細胞集中于部分地區(qū),其他地方細胞較少。相比之下,通電時貼附分布地相對均勻,控制電流時此種現(xiàn)象更為明顯,提示電刺激可能促進細胞在局部遷移,但這改變很有限。同時,在兩種不同方式的通電實驗組中,均未發(fā)現(xiàn)細胞在PPy支架的正負極的分布有明顯區(qū)別。

    (2)細胞形態(tài)

    實驗結(jié)果顯示,電刺激對貼附于PPy上的hUCMSC形態(tài)影響顯著。對照組中,細胞保持梭形,形態(tài)飽滿,分界清晰,細胞匯合少見。培養(yǎng)于PPy表面無電刺激時,hUC-MSC基本保持梭形,細胞間分界清楚,呈平行排列或典型魚群樣生長;施加電刺激后,細胞主要呈扁平薄皮狀,細胞間常匯合成片、分界不清。不同形式的電刺激對細胞形態(tài)影響的比較類似。

    產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能包括:

    (1)細胞形態(tài)改變的主要是由于細胞骨架的重組和細胞膜-骨架聯(lián)系的解體。據(jù)報道,外加電刺激可以引起細胞骨架重排[10],對細胞形狀及變形產(chǎn)生重要影響,從而可能使細胞的外觀產(chǎn)生顯著變化,也對細胞的遷移產(chǎn)生了一定的促進。

    (2)外加電刺激可能導(dǎo)致細胞膜彈性有一定程度的增加,因而進一步影響了細胞的運動以及細胞—細胞間作用[11]。

    (3)對hUC-MSC來說,細胞膜與細胞骨架之間的聯(lián)系相對分化成熟細胞較為松弛[12],從而導(dǎo)致其對外界刺激更加敏感,對外界的反應(yīng)也更加顯著。

    (4)hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)數(shù)天后仍有較多細胞未貼附,說明PPy雖然具有較好的組織相容性,但其表面性質(zhì)仍然較不適宜hUC-MSC,故這也是今后的工作中需要進一步改進的。同時也不排除因為外加電刺激對細胞產(chǎn)生影響,減低了hUC-MSC的貼附性。

    此外,處于電場中和直接與導(dǎo)電材料接觸對細胞的影響有著顯著的不同。實驗中所選擇的外加電刺激強度主要依據(jù)以往文獻報道的數(shù)據(jù)。其中場強100mV/mm及以上在研究電場對細胞作用時較為常用[13-14];電流I=10mA及以上在研究導(dǎo)電流對細胞作用時較為常用[15]。通過實驗結(jié)果可以看出,將適用于電場的數(shù)據(jù)直接套用于導(dǎo)電材料實驗,對于細胞的破壞性可能更大。

    綜上所述,利用生理性電磁場或者外加電磁場對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)是未來研究方向之一,聚吡咯與hUC-MSC相結(jié)合在這個方面具有很強的可操作性,但是現(xiàn)階段仍然面臨很多問題,需要進一步的實驗研究加以解決。

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