基質金屬蛋白酶-9在腦缺血中的研究進展①

徐虹，孫華

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一組Zn2+依賴性蛋白酶，現已發(fā)現20多種，根據蛋白質結構可分為五大類，即基質溶解酶、膠原酶、明膠酶、膜型酶和其他不能分類的基質酶，其主要功能是降解和重塑細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，在正常的胚胎發(fā)育和組織重塑等生理過程以及一些疾病的病理生理中起重要作用。通過降解ECM，MMPs可以對血腦屏障產生的損害，加重腦水腫和出血。MMPs家族可能參與神經系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化、腦外傷、腦炎、腦膜炎、腦血管病變等多種疾病的病理過程。在腦缺血神經炎癥時可因細胞因子等的刺激，基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)大量釋放，進而在缺血局部浸潤形成炎性反應，使血腦屏障通透性增高，并可能參與腦缺血后的繼發(fā)性損傷[1]。MMP-9主要在內皮細胞、膠質細胞、神經元和白細胞表達，幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，在腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury)急性期加重血腦屏障破壞，參與腦水腫和腦出血的組織損傷過程[2]。組織型基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)為特異性的抑制因子，在一些生理和病理過程中，細胞分泌MMPs同時也分泌TIMPs，在體內與MMPs同步表達，二者以1∶1的形式構成復合體。因此各種TIMPs成為目前腦缺血再灌注損傷治療的重要突破點。

1 MMP-9的來源和表達

1.1 MMP-9的來源 MMP-9分子量Mr 92×103，活性分子量為83 kDa，又稱為明膠酶B，其基本結構包括信號肽區(qū)、N-末端前肽區(qū)、催化基團區(qū)、C-末端血紅素結合蛋白樣區(qū)和鉸鏈區(qū)。一經合成即以無活性形式從細胞內分泌到細胞外，且主要由纖溶酶原激活物活化，最后在體內由特殊的蛋白酶切割而產生活性。相關研究從MMP-9陽性細胞的表達、MMP-9基因敲除大鼠等不同途徑探討MMP-9的可能來源，但是它的細胞來源始終沒有被完全認識。

1.2 MMP-9在腦組織中的表達 目前研究提示腦實質成分如內皮細胞，膠質細胞或神經元都可表達MMP-9。相關研究顯示，在腦缺血后1~3 d，MMP-9在缺血核心區(qū)(紋狀體和皮層)表達增加，在腦缺血的急性期，MMP-9主要在內皮細胞表達，其次是在神經元和星形膠質細胞[1]。也有研究顯示，因腦缺血再灌注損傷后的MMP-9不是局部產生的，可能是從循環(huán)中的細胞通過血液通路傳遞過來，中性粒細胞是MMP-9的主要來源[2]。支持這一觀點的是，有學者用細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecular 1,ICAM-1)抗體阻止中性粒細胞對血管內皮細胞的粘附或誘導中性粒細胞減少癥，結果表達95 kDa MMP-9的中性粒細胞數明顯減少[3]。除此之外，體外實驗表明，小膠質細胞也被認為參與腦缺血再灌注損傷，并且可能和腦缺血后出血轉歸有關[4]。另外，在腦缺血修復期(7~14 d)，和MMP-9共表達的星形膠質細胞和神經元還有可能參與了腦缺血的修復過程[1]。因此，從MMP-9的來源來看，目前的結論并不一致，結果的差異可能與體內及體外實驗的差異、動物的年齡、細胞培養(yǎng)的條件(尤其是其他細胞基質蛋白如纖連蛋白、玻連蛋白等的存在)、是否能夠排除內源性基質蛋白酶表達等因素相關。因此，最大程度地控制實驗條件，從形態(tài)學、分子水平及蛋白水平多個角度探討MMP-9的來源可能是今后研究的方向。

2 MMP-9表達的調控及基因多態(tài)性

2.1 MMP-9表達的調控機制 MMPs的表達和活性受到嚴格調控，主要在以下兩個水平進行：①轉錄水平的調節(jié)：在MMPs的合成過程中，mRNA的表達受生長因子、細胞因子、激素等多種因素調節(jié)。白介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等促進MMPs合成，而轉化生長因子(TGF)-β、地塞米松、干擾素(IFN)-γ、肝素等抑制MMPs合成；②酶原激活水平：一般認為MMPs以無活性酶原形式分泌，只有被活化才能降解ECM。MMPs的酶原活化機制主要有3個方面，分別為細胞內活化、被MT-MMPs(包括MMP-14、MMP-15、MMP-16)活化和逐級活化。目前研究結果表明，MMPs的活化機制可能為：在尿激酶-纖溶酶原活化劑或組織纖溶酶原活化劑催化下變成纖溶酶，纖溶酶可部分激活間質膠原酶和基質分解素。

2.2 MMP-9的基因多態(tài)性 人類MMP-9基因位于16q 11.2~13.1，全長7.7 kb，含13個外顯子。已發(fā)現在MMP-9基因中存在多個序列變異，其中關于C-1562/T多態(tài)位點的研究報道較多。MMP-9c-1562T多態(tài)性是MMP-9基因轉錄啟動子上游的1562處存在的C被T取代。因啟動子是參與基因轉錄調控密切相關的調節(jié)序列，因此，這些多態(tài)性的發(fā)生可能直接影響到MMP-9基因的轉錄能力，這一推測目前已被一些研究證實。Zhang等發(fā)現MMP-9啟動子的多態(tài)性與動脈粥樣硬化的程度相關，因C等位基因可與轉錄抑制蛋白結合，而T等位基因可不與轉錄抑制蛋白結合，從而表現出更高的啟動子活性，引起MMP-9基因轉錄增加[5]。因此，MMP-9的不同基因型有可能作為基因背景，決定了不同人群對于某些疾病具有不同的易感性和不同的臨床特征。由于MMP-9的重要生物學作用及其基因的特殊位置，MMP-9的基因多態(tài)性與疾病之間的關系受到普遍重視。不同MMP-9基因型的個體在功能上還可能存在差異，國外已有學者開始對MMP-9的基因多態(tài)性與一些疾病的相關性進行研究，初步的研究結果表明，MMP-9的基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病、急性冠狀動脈綜合征等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關性。MMP-9啟動子區(qū)還存在一個-90(CA)n的多態(tài)性。這個微衛(wèi)星多態(tài)性在人群中以等位基因(CA)14最多見，其次為等位基因(CA)21、(CA)22和(CA)23。啟動子活性體外實驗表明，在成纖維細胞中，含(CA)14的啟動子活性只有含(CA)23啟動子的60%左右。

3 MMP-9與腦缺血

研究表明，動脈粥樣硬化斑塊內MMP-9表達增多，纖維成分大量降解，使斑塊破潰，形成附壁血栓，容易脫落，導致腦缺血發(fā)生，免疫組化和原位雜交研究證實，斑塊中巨噬細胞和血管平滑肌細胞內MMP-9及其mRNA表達明顯增加。臨床試驗中，Loftus等將70例動脈內膜切除術患者分為4組(Ⅰ組無癥狀，Ⅱ組出現癥狀>6個月，Ⅲ組出現癥狀1~6個月，Ⅳ組1個月內出現癥狀)，對所取斑塊行MMP-9的定量測定，結果顯示，Ⅳ組MMP-9水平顯著高于對照組[6]。Kalela等觀察到血漿MMP-9水平與冠狀動脈狹窄程度呈正相關，MMP-9水平越高，狹窄越重，提示血漿MMP-9可作為動脈粥樣硬化及腦梗死等病情活躍的標志物及隨訪指標[7]。動物研究表明，MMP-9的表達在局灶性腦缺血模型中24~48 h到達高峰[8]。在永久性大鼠腦缺血模型中，MMP-9的表達呈雙峰型，即在10~15 h及24 h達到高峰。過去的研究多在1周范圍內研究MMP-9的表達情況，通常認為MMP-9在腦缺血損傷中的作用是負面的。同時，血漿中MMP-9在腦缺血再灌注損傷后1 h也有升高[9]。最近，有文章探討MMP-9在7~14 d內表達的情況，發(fā)現MMP-9在7~14 d可以出現另外一個高峰，而且表達的區(qū)域也由梗死核心區(qū)轉移到缺血周圍地帶，提示這可能與MMP-9參與腦缺血后神經損傷功能的修復有關[2]。與此符合的是，我們之前研究結果表明I/R后腦組織中MMP-9的表達成雙峰形表達(第1峰在48 h，第2峰在144 h)[10]。因此目前研究證實：①MMP-9和腦缺血關系十分密切，腦缺血再灌注損傷發(fā)生的急性期(數小時至48 h)和恢復期(7~14 d)，MMP-9在腦缺血區(qū)域(缺血皮質和紋狀體)出現升高，其表達有可能呈現雙峰形態(tài)，第1個峰值可能與急性期損傷相關，第2個峰值則可能參與了組織的修復過程；②不僅在缺血腦組織局部MMP-9表達，在獨立于血腦屏障的外周血中，MMP-9也有輕微的表達；③MMP-9的表達量和動物神經功能、腦梗死的嚴重程度等呈正相關。

4 MMP-9與出血轉歸

腦缺血后的溶栓治療是目前急性腦缺血的治療措施之一。但是溶栓治療長期以來受人質疑的一個原因是其會增加隨后腦出血的風險。MMP-9被認為參與溶栓治療后腦出血及腦水腫的病理過程。腦缺血發(fā)生后，溶栓治療的患者可激活內源性及外源性的纖溶酶原激活物(tPA)，tPA可能通過LDL受體介導的蛋白通路(LDL receptor related protein,LRP)及蛋白激酶激活受體通路(proteinase activated receptor 1,PAR1)使MMP-9表達升高，從而加重腦缺血損傷、神經死亡及血腦屏障破壞的程度[11]。Castellanos等發(fā)現腦梗死出血轉化患者血漿MMP-9濃度明顯高于未繼發(fā)出血患者，因此認為血漿MMP-9水平增高與急性腦梗死出血轉化的發(fā)生密切相關[12]。Montaner等檢測了39例心源性卒中患者血清MMP-9水平，根據CT檢查結果，將出血轉化分為出血性梗死和實質性血腫，結果發(fā)現MMP-9水平與遲發(fā)性出血轉化有關，且是唯一的預測因子，實質血腫組MMP-9在24 h時達高峰[13]。據此他們認為，MMP-9水平可預測遲發(fā)性出血轉化的發(fā)生，24 h時MMP-9水平增高往往預示著會出現血腫。同時，動物實驗研究證明，在小鼠腦出血模型中，若在野生型小鼠紋狀體內注射MMP-9基因敲除小鼠的血液，就可以明顯緩解腦出血的癥狀[14]，且MMP-9基因敲除的小鼠在早期的腦缺血再灌注損傷中出血轉化的發(fā)生率較野生型小鼠低[15]。但也有不一致的結論，腦缺血后應用重組纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)的副作用(血腦屏障的破壞等)也可能與MMP-9無關[16]。從目前研究來看，無論是臨床還是實驗研究均支持MMP-9水平可以反映腦缺血損傷后出血轉歸的可能性。

5 MMP-9及其抑制劑

MMP-9只有在解朊后才能在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮損傷作用，實驗研究發(fā)現，可以通過人為因素在轉錄、激活、切割以及抑制等水平調節(jié)其活動。目前研究較多的是其抑制劑。目前發(fā)現的金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)分4型：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP以1∶1的化學計量關系與活化的MMPs結合，抑制其話性。在TIMP與MMPs之間存在一定程度的抑制特異性。TIMP-1抑制大多數MMPs的活性，但不包括MMP-2；TIMP-2也是大多數MMPs抑制因子，但是不包 括 MMP-9； TIMP-3 抑 制 MMP-1， MMP-2， MMP-3，MMP-9，MMP-13的活性。腦缺血和(或)再灌注時，MMP-9異常升高，破壞血腦屏障，參與血管源性腦水腫和出血轉化的形成，MMP-9也可能成為穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊和防治卒中的新靶點。因此，人為地調節(jié)MMP-9和TIMP-1之間的平衡，減少MMP-9或增加TIMP-1的含量、功能和活性，或使用人工合成的TIMPs有望成為一種治療缺血性腦血管病的新手段。

Mishiro等聯合應用tPA和一種新型的廣譜MMPs抑制劑研究腦缺血大鼠模型，結果表明，聯合治療可能通過對緊密連接蛋白(tight junction proteins,TJPs)的保護，減少應用tPA 7 d后大鼠的死亡率[17]。Liu等選用選擇性的MMP-2/9抑制劑SB-3CT，說明其在腦缺血早期可以通過調節(jié)閉鎖蛋白的降解和閉鎖蛋白-5的重新分配減緩腦缺血損傷[18]。Kanazawa等研究發(fā)現血管內皮生長因子(vascular endothelial growth,VEGF)在腦缺血后表達升高，激活MMP-9，因此VEGF的抑制劑也可能成為減少腦水腫、神經損傷及減輕應用tPA后出血轉化的新途徑[19]。此外，促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)被發(fā)現在體內體外動物腦缺血模型中具有保護作用，但是到目前為止，機制不明。有學者研究在腦缺血中，調整信號分子Janus激酶2、信號轉導和轉錄激活蛋白-3(signal transducers and activators of transcription protein-3,STAT-3)以及TIMP-1可能是紅細胞生成素(EPO)誘導的神經保護作用的主要介質[20]。同時，也有相當的研究報道，可以通過干預炎癥因素調節(jié)MMP-9的表達，最終減輕腦缺血再灌注損傷[21]。另外，自由基抑制劑、Rho激酶抑制劑、間斷的頸內動脈生理鹽水灌注等被認為可以通過降低MMP-9表達減輕腦缺血再灌注損傷[22-24]。但是也有報道稱，MMP-9及其抑制劑在腦缺血中的作用可以是雙向的，即既可以加重腦缺血損傷，也可能參與損傷的修復過程。因此多數文獻支持，腦缺血再灌注損傷之后血腦屏障的損傷可由3個方面產生：①腦缺血后外源性的tPA；②損傷后產生的氧化應激產物，如氧自由基等；③血腦屏障降解酶類，如MMPs家族。大多數的研究者試圖從MMPs的廣譜或者非廣譜的抑制劑、氧自由基拮抗劑以及tPA受體拮抗劑等方面保護血腦屏障。

6 小結與展望

綜上所述，體內和體外實驗均表明，MMP-9表達水平是反應腦缺血再灌注損傷后腦缺血損傷程度、腦梗死面積以及預后的一個重要指標。目前對MMP-9的干預還處在動物實驗階段，通過影響MMP-9的上游信號，找到有效干預MMP-9表達的方法，對腦缺血的實驗研究及預防治療具有重要意義。

[1]Zhao BQ,Wang S,Kim HY,et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke[J].Nat Med,2006,12(4):441-445.

[2]Wang G,Guo Q,Hossain M,et al.Bone marrow-derived cells are the major source of MMP-9 contributing to blood-brain barrier dysfunction and infarct formation after ischemic stroke in mice[J].Brain Res,2009,1294:183-192.

[3]Justicia C,Panes J,Sole S,et al.Neutrophil infiltration increases matrix metalloproteinase-9 in the ischemic brain after occlusion/reperfusion of the middle cerebral artery in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(12):1430-1440.

[4]Del ZG,Frankowski H,Gu YH,et al.Microglial cell activation is a source of metalloproteinase generation during hemorrhagic transformation[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(5):919-932.

[5]Zhang B,Ye S,Herrmann SM,et al.Functional polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of coronary atherosclerosis[J].Circulation,1999,99(14):1788-1794.

[6]Loftus IM,Naylor AR,Goodall S,et al.Increased matrix metalloproteinase-9 activity in unstable carotid plaques.A potential role in acute plaque disruption[J].Stroke,2000,31(1):40-47.

[7]Kalela A,Kyiv TA,Sisto T,et al.Serum matrix metalloproteinase-9 concentration in angiographic ally assessed coronary artery disease[J].Scand J Clan Lab Invest,2002,62(5):337-342.

[8]Garcia JH,Liu KF,Yoshida Y,et al.Influx of leukocytes and platelets in an evolving brain infarct(Westar rat)[J].Am J Pathos,1994,144(1):188-199.

[9]Martin A,Rojas S,Chamorro A,et al.Why does acute hyperglycemia worsen the outcome of transient focal cerebral ischemia?Role of corticosteroids,inflammation,and protein O-glycosylation[J].Stroke,2006,37(5):1288-1295.

[10]徐虹,洪禮傳,黃艷秋等.針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質金屬蛋白酶、細胞間黏附分子表達的影響[J].基礎醫(yī)學與臨床,2010,30(7):356-361.

[11]Yamashita T,Abe K.Therapeutic approaches to vascular protection in ischemic stroke[J].Acta Med Okayama,2011,65(4):219-223.

[12]Castellanos M,Leira R,Serena J,et al.Plasma metalloproteinase-9 concentration predicts hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke[J].Stroke,2003,34(1):40-45.

[13]Montaner J,Alvarez-Sabin J,Molina CA,et al.Matrix metalloproteinase expression is related to hemorrhagic transformation after cardioembolic stroke[J].Stroke,2001,32(12):2762-2767.

[14]Tejima E,Zhao BQ,Tsuji K,et al.Astrocytic induction of matrix metalloproteinase-9 and edema in brain hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(3):460-468.

[15]Suofu Y,Clark JF,Broderick JP,et al.Matrix metalloproteinase-2 or-9 deletions protect against hemorrhagic transformation during early stage of cerebral ischemia and reperfusion[J].Neuroscience,2012,212:180-189.

[16]Copin JC,Bengualid DJ,Da SR,et al.Recombinant tissue plasminogen activator induces blood-brain barrier breakdown by a matrix metalloproteinase-9-independent pathway after transient focal cerebral ischemia in mouse[J].Eur J Neurosci,2011,34(7):1085-1092.

[17]Mishiro K,Ishiguro M,Suzuki Y,et al.A broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor prevents hemorrhagic complications induced by tissue plasminogen activator in mice[J].Neuroscience,2012,205:39-48.

[18]Liu J,Jin X,Liu KJ,et al.Matrix metalloproteinase-2-mediated occludin degradation and caveolin-1-mediated claudin-5 redistribution contribute to blood-brain barrier damage in early ischemic stroke stage[J].J Neurosci,2012,32(9):3044-3057.

[19]Kanazawa M,Igarashi H,Kawamura K,et al.Inhibition of VEGF signaling pathway attenuates hemorrhage after tPA treatment[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(6):1461-1474.

[20]Souvenir R,Fathali N,Ostrowski RP,et al.Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 mediateserythropoietin-induced neuroprotection in hypoxia ischemia[J].Neurobiol Dis,2011,44(1):28-37.

[21]Morancho A,Rosell A,Garcia-Bonilla L,et al.Metalloproteinase and stroke infarct size:role for anti-inflammatory treatment?[J].Ann N YAcad Sci,2010,1207:123-133.

[22]Ishiguro M,Kawasaki K,Suzuki Y,et al.A Rho kinase(ROCK)inhibitor,fasudil,prevents matrix metalloproteinase-9-related hemorrhagic transformation in mice treated with tissue plasminogen activator[J].Neuroscience,2012,220:302-312.

[23]Takamiya M,Miyamoto Y,Yamashita T,et al.Strong neuroprotection with a novel platinum nanoparticle against ischemic stroke-and tissue plasminogen activator-related brain damages in mice[J].Neuroscience,2012,221:47-55.

[24]Ji YB,Wu YM,Ji Z,et al.Interrupted intracarotid artery cold saline infusion as an alternative method for neuroprotection after ischemic stroke[J].Neurosurg Focus,2012,33(1):E10.