星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選丹參中丹參總酚酸的提取工藝

盧君蓉，傅超美，劉芳，章津銘，林俊芝，胡慧玲

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，味苦、性微寒。歸心、肝經(jīng)，為常用川產(chǎn)道地藥材之一，具有活血化瘀、涼血消癰的功效［1］。所含丹參總酚酸為其主要的水溶性有效成分，主要含有丹酚酸B、迷迭香酸等;丹參總酚酸提取物被收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部植物油脂和提取物項(xiàng)下［2］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)為國(guó)內(nèi)外近年來(lái)常用于優(yōu)化藥材和制劑提取工藝、處方篩選的方法，該方法簡(jiǎn)便、直觀，且在模型建立上采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)合相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值［3-9］。本試驗(yàn)中引入星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選丹參中丹參總酚酸的提取工藝。

1 儀器與試藥

LC—10AT高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社);UV—1100紫外—分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器公司);BP211D電子分析天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司);BP121S電子分析天平(萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司);202-2型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。

丹參藥材購(gòu)于成都荷花池中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館盧先明教授鑒定為丹參Salvia miltiorrhizaBge.的根及根莖。丹酚酸B對(duì)照品(成都曼斯特生物制品公司，批號(hào)A0056，純度≥98%)，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

試驗(yàn)中參照《中國(guó)藥典》2010年版一部丹參藥材項(xiàng)下定量測(cè)定方法［2］和文獻(xiàn)方法［10］對(duì)各樣品中丹酚酸B和丹參總酚酸的含有量進(jìn)行測(cè)定。

2.1 丹酚酸B測(cè)定［2］

2.1.1 色譜條件Diamonsil鉆石ODS-C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫25℃;流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加75%甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，得質(zhì)量濃度為0.146 mg/mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 樣品溶液的制備取丹參粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取2.1.2項(xiàng)下丹酚酸B對(duì)照品溶液10、12、14、16、18 μL，分別注入高效液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，丹酚酸B的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=1×106X－225 177(r=0.999 9)，進(jìn)樣量在1.47～2.94 μg范圍內(nèi)，線性范圍良好。2.1.5藥材定量測(cè)定取已制備好的丹參樣品溶液，共3份，每份進(jìn)樣10 μL，計(jì)算丹參樣品中丹酚酸B的含有量，得到丹參樣品中丹酚酸B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.62%，高于2010年版《中國(guó)藥典》一部丹參項(xiàng)下含丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0%的規(guī)定，為合格藥材。

2.2 丹參總酚酸定量測(cè)定［10］

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加蒸餾水定容至10 mL棕色量瓶中，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，得質(zhì)量濃度為0.146 mg/mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液，分別從其中精密移取0、0.3、0.6、1.3、2.5、5 mL加水定容至10 mL，精密移取稀釋液2 mL，分別依次加入0.5%的NaNO25 mL、10%的Al(NO3)30.5 mL、1 mol/L的NaOH 5 mL，靜置顯色后，備用。

2.2.2 樣品溶液的制備取各試驗(yàn)安排下的提取液續(xù)濾液1 mL，加水定容至25 mL，再精密吸取1 mL溶液，定容至10 mL，精密移取稀釋液2 mL，按2.2.1項(xiàng)下顯色方法顯色，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以空白顯色溶液為對(duì)照，取2.2.1項(xiàng)下丹酚酸B對(duì)照品溶液，分別在499 nm條件下測(cè)定其吸光度，以其吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=4.467 7×X－0.002 3(r=0.999)，質(zhì)量濃度在0.001～0.01 mg/mL范圍內(nèi)，線性范圍良好。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)丹參酚酸類(lèi)為水溶性成分，且受熱易分解，預(yù)試驗(yàn)對(duì)超聲法、回流法、溫浸法3種方法進(jìn)行比較，以溫浸法較好，故以溶媒用量、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際，設(shè)定提取次數(shù)為2次，其余因素的水平據(jù)試驗(yàn)結(jié)果而定。影響因素及水平見(jiàn)表1，分別取50 g丹參藥材粉末，以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量、干膏量三者的加權(quán)評(píng)分值為指標(biāo)，按表2中試驗(yàn)安排進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 影響因素及水平

2.4 模型擬合用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量、干膏量三者的總體歸一值為指標(biāo)對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。

所得多元線性回歸方程:Y=0.64+0.14X1－0.075X2－0.039X3(F=16.93，r=0.872 1，P＜0.001);

擬合所得二項(xiàng)式方程:Y=－3.594 97+0.286 16×A+0.062 018×B+0.012 321×C－2.580 44×10－3×A×B－3.684 45×10－4×A×C－2.629 61×10－4×B×C+1.484 3×10－3×A2－1.322 6×10－4×B2+4.378 72×C2×10－5(F=8.07，r=0.937 5，P＜0.001 5)。采用相關(guān)系數(shù)對(duì)兩種擬合方式進(jìn)行比較可知，采用二項(xiàng)式方程擬合較好，可信度較大，對(duì)結(jié)果的模擬優(yōu)化效果較好。

2.5 工藝優(yōu)化與估測(cè)因變量曲面圖是三維圖，只能表達(dá)兩個(gè)自變量的函數(shù)，因此固定三個(gè)自變量之一為中值，以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制因變量三維圖及等高圖。見(jiàn)圖1～3。

由溶媒用量與溫浸溫度兩因素作圖可知，在溶媒用量為10.5～12.0倍、溫浸溫度為60～75℃范圍內(nèi)，提取的總體歸一值最高;由溶媒用量與溫浸時(shí)間兩因素作圖可知，當(dāng)溶媒用量在10.5～12.0倍、溫浸時(shí)間在105～150 min范圍內(nèi)，提取的總體歸一值最高;由溫浸溫度與溫浸時(shí)間作圖可知，當(dāng)溫浸溫度在65～67.5℃、溫浸時(shí)間在127.5～150 min范圍，提取的總體歸一值值最高。綜合以上信息，可得選取的最佳范圍為溶媒用量為10.5～12.0倍、溫浸溫度為65～67.5℃、溫浸時(shí)間為127.5～150 min。

考慮到工業(yè)生產(chǎn)中關(guān)心投入產(chǎn)出比和成本問(wèn)題，以及預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，故將本試驗(yàn)優(yōu)選的丹參總酚酸提取的最佳工藝為丹參藥材粉末(過(guò)一號(hào)篩)，加入11倍量水，在65℃下提取2次，每次130 min。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖1 溶媒用量與溫浸溫度對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

圖2 溶媒用量與溫浸時(shí)間對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)以上所得工藝進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)表3。

圖3 溫浸溫度與溫浸時(shí)間對(duì)OD影響的三維圖和等高圖

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)

3 討論

3.1 丹參為常用川產(chǎn)道地中藥材之一，在本試驗(yàn)中以丹酚酸B含有量、丹參總酚酸含有量及干膏量三者的總體歸一值為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化丹參總酚酸的提取工藝，結(jié)果表明，建立的丹參總酚酸評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行。同時(shí)，對(duì)本試驗(yàn)所建立的最佳工藝與《中國(guó)藥典》工藝進(jìn)行了比較:參照《中國(guó)藥典》2010年版一部所收載的丹參總酚酸提取物項(xiàng)下制備樣品，對(duì)其進(jìn)行了丹酚酸B的測(cè)定，結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的最佳工藝丹酚酸B轉(zhuǎn)移率高于《中國(guó)藥典》方法。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選中藥材等的提取工藝，考察因素的水平范圍更大，同時(shí)采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，可信度較好，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值，本試驗(yàn)的結(jié)果可以為進(jìn)一步完善丹參總酚酸提取物制備方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法所得結(jié)果更加直觀、便于分析。進(jìn)一步分析本試驗(yàn)擬合所得二項(xiàng)式方程及變量三維圖，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的各因素中溶媒用量、溫浸時(shí)間與試驗(yàn)結(jié)果成正相關(guān)，且溶媒用量影響較大;而溫浸溫度在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，超過(guò)一定值后成負(fù)相關(guān)，且對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大于溫浸時(shí)間。此結(jié)果與單因素預(yù)試驗(yàn)所得結(jié)果趨勢(shì)相吻合，且所得的結(jié)果參數(shù)更加明確。本法更適合于探索性的試驗(yàn)研究，且試驗(yàn)結(jié)果精確度較高，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中更具優(yōu)勢(shì)。

3.3 本試驗(yàn)中所建立的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化丹參總酚酸的提取工藝，為丹參及其他中藥材的提取、加工和開(kāi)發(fā)提供了參考和依據(jù)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)川產(chǎn)道地藥材奠定了基礎(chǔ)。

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