生物傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

孫永明 陳建紅 錢跟林 楊敦祥 陸 瑾

（1.江蘇省吳江市畜牧獸醫(yī)站，吳江 215200；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095）

生物傳感器是將生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合，以生物學(xué)組件作為主要功能性元件，能夠感受規(guī)定的被檢測(cè)物質(zhì)的量，并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可識(shí)別信號(hào)的器件或裝置。它一般由生物識(shí)別元件、轉(zhuǎn)換元件、機(jī)械元件和電氣元件所組成[1]。生物傳感器根據(jù)分子識(shí)別元件與待測(cè)物結(jié)合的性質(zhì)可分為：（1）利用酶的專一性和催化性的催化型生物傳感器（酶?jìng)鞲衅骱臀⑸飩鞲衅鞯龋?；?）利用分子間特異親和性的親和型生物傳感器（免疫傳感器和DNA傳感器等）。利用換能器的性質(zhì)，可將生物傳感器分為：電化學(xué)生物傳感器、壓電晶體生物傳感器和光纖生物感器等[2]。其中，上述許多產(chǎn)品具有實(shí)用開發(fā)價(jià)值。

毒素（toxin）是由生物體產(chǎn)生的，其極少量即可引起動(dòng)物中毒。按來(lái)源可分為動(dòng)物毒素、植物毒素和微生物毒素。其中，微生物毒素包括真菌毒素和單細(xì)胞藻類（如原核的藍(lán)藻和真核的甲藻）毒素等[3]。毒素對(duì)食品生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的危害性很大，2011年我國(guó)發(fā)生的黃曲霉毒素污染食用油和牛奶的事件在全國(guó)引起了很大反響。因此，加強(qiáng)對(duì)其檢測(cè)至關(guān)重要。本文就生物傳感器在幾種常見真菌毒素的檢測(cè)中的應(yīng)用狀況及應(yīng)用前景進(jìn)行概述。

1 生物傳感器的研究現(xiàn)狀

目前，生物傳感器應(yīng)用較多的領(lǐng)域是在醫(yī)療、醫(yī)藥、生物工程、環(huán)境保護(hù)、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧等與生命科學(xué)關(guān)系密切的一些領(lǐng)域。例如，臨床上用免疫傳感器等生物傳感器來(lái)檢測(cè)體液中的各種化學(xué)成分，為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)；生物工程產(chǎn)業(yè)中用生物傳感器監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器內(nèi)各種物理、化學(xué)、生物的參數(shù)變化以便加以控制；環(huán)境監(jiān)測(cè)中用生物傳感器監(jiān)測(cè)大氣和水中各種污染物質(zhì)含量，食品行業(yè)中用生物傳感器檢測(cè)食品中營(yíng)養(yǎng)成分和有害成分的含量、食品的新鮮程度等[4]。

早在1979年，Matssunage等開發(fā)了非染料偶合的燃料電池型微生物電極系統(tǒng)，檢測(cè)范圍107～109cfu/ml。1982年，Nishikawa等以2，6-二氯酚靛酚為媒介，并用濾膜預(yù)富集制成的生物傳感器對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)極限可達(dá)104cfu/ml。1989年，Muramatsu等用一個(gè)壓電晶體傳感器系統(tǒng)測(cè)定病原微生物（Canolidaalbicans），測(cè)定范圍106～108cfu/ml。Cao等在1995年應(yīng)用光纖傳感器檢測(cè)分析血清、全血、血漿中的鼠疫耶爾森氏菌F1抗原；Rowe-Taitt等在2 000年使用光纖傳感器檢測(cè)了炭疽桿菌、土拉弗氏菌等；Anderson等應(yīng)用光纖傳感器RAPTOR，先后檢測(cè)了鼠疫桿菌F1抗原、葡萄球菌腸毒素、蓖麻毒素、炭疽芽孢、土拉弗氏菌等[2-3]。2004年在西班牙格拉納達(dá)會(huì)展中心召開的第八屆世界生物傳感器大會(huì)對(duì)9個(gè)專題進(jìn)行了分組討論。包括核酸傳感器和DNA芯片、免疫傳感器、酶?jìng)鞲衅?、組織和全細(xì)胞傳感器、用于生物傳感器的天然與合成受體、新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)、系統(tǒng)整合/蛋白質(zhì)組學(xué)/單細(xì)胞分析、生物電化學(xué)/生物燃料/微分析系統(tǒng)、商業(yè)發(fā)展和市場(chǎng)[5-7]。其中，單分子/細(xì)胞分析和生物印跡生物傳感器由于它們良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)及在生命科學(xué)研究中的重要位置成為與會(huì)學(xué)者討論的熱點(diǎn)問(wèn)題[8-10]。

2 生物傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

真菌毒素是真菌分泌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。常見污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭毒素、雜色曲霉素、T-2毒素、伏馬素、鐮刀菌稀醇類毒素、展青霉素和橘霉素等。檢測(cè)食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等[11]。近20多年來(lái)，醫(yī)學(xué)方法在真菌毒素的檢測(cè)中得到了較好的應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器快速檢測(cè)真菌毒素的方法也有研究報(bào)道和應(yīng)用，其中以免疫傳感器用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1和伏馬素B1的研究報(bào)道為最多[12]。此外，也有運(yùn)用微生物傳感器和以纖毛蟲微生物敏感材料的傳感器檢測(cè)展青霉素、黃曲霉毒素B1和T-2毒素的研究報(bào)道[13]。

2.1 黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是目前所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的真菌毒素，能引起人類（尤其是兒童）以及各種動(dòng)物的急性中毒和死亡，被國(guó)際癌癥研究中心（ICRC）定為是人類的致癌劑。通過(guò)光纖免疫傳感器來(lái)測(cè)定花生和玉米抽提物，可測(cè)得0.05ng/ml的AFB1

[14-15]。Stracha等人用一種傳感器來(lái)檢測(cè)食物中的AFB1，靈敏度也很高，可達(dá)4ng/ml，分析時(shí)間只用了8min，而且特異性強(qiáng)[16]。Carter等人利用光纖免疫傳感器來(lái)測(cè)定花生和玉米抽提物中的AFB1，檢測(cè)限可達(dá)0.05ng/ml[17]。

2.2 雜色曲霉素

雜色曲霉素（Sterigm atocystin，ST），是黃曲霉毒素合成途徑的前體（sterigm atocystin（ST）-O-m ethylsterigm atocystin（OM ST）-AFB1）。但雜色曲霉素由于污染含量高，危害性高于黃曲霉毒素[42]。

將黃曲霉毒素氧化酶（AFO）固定在殼聚糖（CS）-單壁碳納米管（SWCNTs）雜交膜中，組裝在聚鄰苯二胺（POPD）修飾的金電極（Au）表面，制備了對(duì)雜色曲霉素（ST）敏感的生物傳感器（AFO/CS-SWCNTs/POPD/Au）。運(yùn)用原子力顯微鏡（AFM）、傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）和交流阻抗技術(shù)（EIS）對(duì)電極組裝過(guò)程進(jìn)行了表征。循環(huán)伏安法研究表明，AFO在修飾電極上發(fā)生了準(zhǔn)可逆的氧化還原反應(yīng)，是表面控制過(guò)程，其式量電位為0.436 V（vs.Ag/AgCl），說(shuō)明包埋在CS-SWCNTs中的AFO和電極之間發(fā)生了直接電子傳遞。AFO修飾電極對(duì)ST具有明顯的電催化作用，其表觀米氏常數(shù)appMK為7.13μmol/ml，催化電流與ST濃度在10～310 ng/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997，檢出限為3 ng/ml（S/N=3），響應(yīng)時(shí)間小于10s。組裝的生物傳感器具有較好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，連續(xù)檢測(cè)20 ng/ml的ST標(biāo)準(zhǔn)溶液11次，電流值RSD為3.9%；放置1個(gè)月后，其電流響應(yīng)值仍為初始值的85.6%[19-20]。

該方法具有較高的選擇性和靈敏度，應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，其回收率在87.6%～105.5%之間[19-20]。建立的ST含量的電化學(xué)測(cè)定方法簡(jiǎn)便快捷，測(cè)定結(jié)果令人滿意。

2.3 伏馬菌素B1

伏馬菌素B1（Fum onisinsB1，F(xiàn)B1）是天然污染玉米食品和飼料的主要毒素組分，與馬腦白質(zhì)軟化癥、豬的肺水腫癥和人類食道癌等人、畜疾病有關(guān)。Wayne等人[21]用表面等離子體振子共振免疫傳感器來(lái)檢測(cè)玉米抽提物中的FB1濃度，可達(dá)到檢測(cè)下限為50ng/ml，分析時(shí)間為10min；Thamlpson[22]等人用光纖免疫傳感器來(lái)檢測(cè)FB1，可測(cè)得下限為10ng/ml，響應(yīng)時(shí)間提高到4min。微生物傳感器[23]對(duì)幾種突變物AF-2、絲裂霉素、克菌丹、黃曲霉素B1、硝基胍的檢出限分別為1.6，0.5，0.9，0.8μg/m L，比采用Am es等方法不僅時(shí)間短（前者60min，后者少則2-3d，長(zhǎng)則7d），靈敏度也高（前者對(duì)AF-2的最低限為1.6μg/ml，后者為10μg/ml）。

該傳感器工作菌株為枯草桿菌，已知該菌株野生型（Rec+）的DNA在受到化學(xué)損傷后能通過(guò)分子重組而得到修復(fù)，故能繼續(xù)繁殖；而喪失這種自我修復(fù)能力的缺陷型菌（Rec-）在DNA受到化學(xué)損傷后，因失去繁殖能力而死亡。將Rec+和Rec-菌株分別固定在一對(duì)氧電極表面，即構(gòu)成致突變傳感器[24]。

3 生物傳感器的應(yīng)用前景

生物傳感器的問(wèn)世極大地簡(jiǎn)化了微生物毒素的分析方法，不僅減少了分析時(shí)間，提高了靈敏度，使測(cè)定過(guò)程變得更為簡(jiǎn)單，而且便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，使微生物毒素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能。盡管現(xiàn)在生物傳感器的應(yīng)用受到其穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命等諸多限制，再加上待測(cè)物成分多且含量差異大、抗體種類少和不穩(wěn)定等問(wèn)題，許多生物傳感器的研究還處在實(shí)驗(yàn)階段，實(shí)際應(yīng)用時(shí)環(huán)境和樣品的復(fù)雜性成為制造此類傳感器的主要障礙，限制了實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的生物傳感器的數(shù)量。但是，由于生物傳感器具有高選擇性、響應(yīng)快，操作簡(jiǎn)單、攜帶方便和適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，所以仍是目前重點(diǎn)研究的對(duì)象。

對(duì)生物傳感器檢測(cè)微生物毒素的研究是各國(guó)科學(xué)家積極探索的課題，這些制約條件也是各國(guó)科學(xué)家致力于解決的問(wèn)題。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、材料技術(shù)、生物技術(shù)等的發(fā)展，生物傳感器現(xiàn)存的諸多不足將有望得到完善，在微生物毒素檢測(cè)中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛，并且在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面無(wú)疑將會(huì)發(fā)揮更大的作用。生物傳感器在微生物毒素檢測(cè)中的發(fā)展方向，主要是進(jìn)一步拓寬應(yīng)用范圍；由單一功能向多功能發(fā)展；與其他儀器集成，以提高靈敏度和分析速度，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)；向便攜式，操作簡(jiǎn)便、低成本，商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展。

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