中紅外反射光譜結(jié)合偏最小二乘法快速測(cè)定天麻中天麻素

杜偉鋒，王勝波，叢曉東，張?jiān)?，蔡寶昌?

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江杭州311401;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029)

天麻Gastrodia elataBl.為蘭科多年生寄生植物，其干燥塊根作為藥用，是我國(guó)貴重中藥之一，主產(chǎn)于云南、四川、陜西及貴州等地。早在2000年前《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載了天麻具有平肝息風(fēng)止痙之功效，主要用于治療頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定以高效液相色譜法測(cè)定天麻中天麻素含有量作為檢測(cè)指標(biāo)［1］，但該方法分析耗時(shí)較長(zhǎng)、操作比較繁瑣、成本較高，不適用于飲片企業(yè)大批量樣品的含有量測(cè)定。紅外光譜技術(shù)不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)過(guò)程不消耗任何化學(xué)品，成為真正的無(wú)損、綠色檢測(cè)技術(shù)，被廣泛用于樣品中成分含有量的快速測(cè)定［2-14］。筆者前期研究了利用近紅外光譜法測(cè)定了天麻中天麻素［15］，本實(shí)驗(yàn)將利用傅里葉變換中紅外光譜(FTIR)和衰減全反射(ATR)技術(shù)，建立天麻素中紅外光譜快速測(cè)定模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)天麻中天麻素的快速測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀(Perkin Elmer公司)，包括衰減全反射附件，DTGS檢測(cè)器;Dionex U3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安儀器公司);梅特勒XS-105電子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland);電熱恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司);KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥天麻素對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110807-200205;乙醇、磷酸均為分析純;乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品天麻飲片分別從浙江、安徽、云南、貴州等12個(gè)不同產(chǎn)地收集，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司鄭建寶主管中藥師鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖加工炮制成的飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 中紅外光譜的采集將天麻飲片粉碎，過(guò)100目篩，取約10 g粉末放入ATR樣品槽內(nèi)，混合均勻，以空氣為背景，按下述實(shí)驗(yàn)條件采集天麻的紅外光譜圖。光譜分辨率:4 cm－1，光譜范圍:4 000～650 cm－1，掃描次數(shù):16次，空氣濕度:60%。

圖1 天麻校正集紅外光譜疊加圖

2.2 天麻素定量HPLC分析［1］色譜柱:Dionex Acclaim 120 C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.05%磷酸溶液(3∶97)，等度洗脫15min;柱溫:30℃;體積流量:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;進(jìn)樣量:10 μL。以天麻素峰面積定量，采用外標(biāo)法計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。61批樣品中天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%～1.69%。

2.3 建立模型的方法運(yùn)用Spectrum Quant+分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選擇多元信號(hào)校正(MSC)以解決基線(xiàn)漂移，進(jìn)行了偏最小二乘法(PLS1和PLS2)和主成分回歸法(PCR)建模算法的比較。結(jié)果表明PLS所建立的模型優(yōu)于PCR法，因?yàn)橹粶y(cè)定了一種成分，無(wú)需考慮組分間的相關(guān)性，故選擇采用PLS1法建立定量校正模型。以相關(guān)系數(shù)(R2)和校正標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEE)為指標(biāo)選擇建模參數(shù)和優(yōu)化模型結(jié)構(gòu)，以預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEP)來(lái)考察模型的預(yù)測(cè)性能和推廣能力。

3 定量模型的建立

3.1 驗(yàn)證方法的選擇由于樣品數(shù)量不夠多，故采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證方法。該方法每次從樣品集中除去一個(gè)或一組樣品，這個(gè)(組)樣品被用于驗(yàn)證模型，其余樣品用于該系統(tǒng)的校正。然后重復(fù)這個(gè)過(guò)程，直到全部樣品都被用于驗(yàn)證一次。

3.2 樣品選擇從61份樣品中任意選擇5份樣品作為驗(yàn)證集，56份樣品作為樣品集，經(jīng)Outliers優(yōu)化，49號(hào)樣品為溢出值，并將其從建模樣品中剔出，以保證模型的準(zhǔn)確性。

3.3 處理方法的選擇考察了不同的處理方法，包括變量數(shù)、平滑(Smooth)、歸一化(Normalization)、基線(xiàn)校正(Baseline)等，以R2、SEE、SEP作為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，變量數(shù)為10，經(jīng)5點(diǎn)二階導(dǎo)、5點(diǎn)平滑處理的模型是最優(yōu)的，此時(shí)的R2、SEE、SEP分別為99.46、0.028 13、0.385 1。

表1 天麻選擇不同處理方法建模的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.4 校正模型選擇變量數(shù)為10，經(jīng)5點(diǎn)二階導(dǎo)數(shù)和5點(diǎn)平滑處理，4 000～650 cm－1波段建立天麻校正模型，紅外預(yù)測(cè)值與色譜實(shí)際值的PLS校正模型如圖2所示，R2=99.46，SEE=0.028 13，SEP=0.385 1。

3.5 檢驗(yàn)集預(yù)測(cè)結(jié)果用建立的最佳校正模型，對(duì)驗(yàn)證樣品的天麻素含有量進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)集結(jié)果見(jiàn)表2。由結(jié)果可知該定量模型可靠，可以作為快速測(cè)定的方法。

圖2 天麻定量測(cè)定中紅外光譜模型

表2 天麻中天麻素含有量的預(yù)測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中紅外光譜衰減漫反射技術(shù)，采用偏最小二乘法建立了天麻中天麻素含有量的中紅外模型，可快速測(cè)定天麻中天麻素含有量，為飲片企業(yè)的質(zhì)量檢驗(yàn)降低了成本，便于推廣使用。

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