三氧化二砷誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7凋亡對(duì)端粒酶活性的影響

陳智嘉，谷 勵(lì)，王景龍，陳思嘉

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林省臨江市醫(yī)院，吉林 臨 江 134600;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所，吉林 長(zhǎng)春 130122)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡也趨于年輕化。近年來研究發(fā)現(xiàn)As2O3不僅對(duì)APL細(xì)胞，而且對(duì)其他血液腫瘤細(xì)胞［1－2］和許多實(shí)體瘤細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡作用［3－4］。Wang 等［5］研究表明端粒酶與惡性腫瘤發(fā)生有著緊密的關(guān)聯(lián)，p21特異性核苷酸序列能夠抑制端粒酶的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。也許端粒酶的活性指標(biāo)在治療惡性腫瘤的過程能提供新的策略。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)As2O3對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用及在不同濃度下端粒酶活性的變化進(jìn)行了研究。以期為治療乳腺癌的過程中提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞株 純?cè)噭〢s2O3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，配成(1 mmol·L－1)，溶于 PBS 液，凍存;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶實(shí)驗(yàn)耗材等購(gòu)自Gibco公司;DMSO(生工生物);RT-PCR kit寶生物工程(大連)有限公司;其他試劑均由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，本室自己傳代保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞采用開放式單層貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI 1640(含10%小牛血清，青霉素100 kU·L－1，鏈霉素 1 00 mg·L－1)，培養(yǎng)條件為 3 7℃，5%CO2，相對(duì)飽和濕度。每日觀察生長(zhǎng)情況，貼壁2～5 d傳代1次。傳代時(shí)用0.25%胰酶消化后，加入培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，繼續(xù)傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞系，制成每升約含有1×108個(gè)單細(xì)胞懸液。分別接種于96孔板，每孔加細(xì)胞懸液100 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h后。將實(shí)驗(yàn)分6組即對(duì)照組和5給藥組，按分組情況分別加入(0.5，0.8，1.0，1.5 和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔，每孔終體積200 μl，培養(yǎng)48 h后，每孔加入50 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，充分振蕩10 min，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處吸光度值。計(jì)算細(xì)胞成活率/%=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

1.4 抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性 依據(jù)PCR-ELISA方法平均值來測(cè)定端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性，首先培養(yǎng)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞系加入終濃度分別為(0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 2 4 h后進(jìn)行裂解細(xì)胞通過PCR-ELISA方法測(cè)定其平均值。同時(shí)加入1.5 μmol·L－1的 A s2O3后分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后測(cè)定其平均值。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測(cè)定As2O3對(duì)細(xì)胞存活率的影響 通過MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組比，給藥組的細(xì)胞存活率隨著As2O3的濃度的增加明顯呈現(xiàn)劑量依賴性降低。其中給藥濃度為2.0 μmol·L－1，細(xì)胞的存活率為(41.69 ± 0 .25)%(P＜0.01)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可以作為抑制癌細(xì)胞增殖的參考數(shù)據(jù)。

2.2 端粒酶活性的變化 端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核糖核酸蛋白酶，通過延長(zhǎng)端粒DNA從而阻滯因端粒酶縮短而誘發(fā)的細(xì)胞衰老，使細(xì)胞具有無限增殖能力。因此，端粒酶與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。按照說明書進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)，在酶標(biāo)儀中得到端粒酶的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組組相比，當(dāng) As2O3達(dá)到 1.5、2.0 μmol·L－1時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。當(dāng) As2O3濃度為1.5 mmol·L－1，時(shí)間達(dá)72 h時(shí)As2O3抑制端粒酶的活性經(jīng)PCR-ELISA方法檢測(cè)均具有時(shí)間－濃度的依賴性結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

As2O3作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病過程取得了明顯的療效。近年來研究表明As2O3能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡，諸如急性早幼粒白細(xì)胞、骨髓癌細(xì)胞、神經(jīng)瘤細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、惡性腎腫瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、喉癌細(xì)胞。對(duì)(1)通過MTT法測(cè)定As2O3對(duì)細(xì)胞存活率的影響;(2)通過PCR-ELISA方法測(cè)定端粒酶活性的變化;端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核糖核酸蛋白酶，能在多種腫瘤中高表達(dá)，而在良性和正常組織中低表達(dá)，是腫瘤預(yù)后和重要的抗腫瘤靶點(diǎn)［6］。據(jù)最近研究報(bào)道端粒酶在不同的細(xì)胞周期階段發(fā)揮著重要的作用，尤其在細(xì)胞G0/G1活性明顯增強(qiáng)［7］。通過用PCR-ELISA法測(cè)定經(jīng)As2O3處理過的乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性的變化，我們發(fā)現(xiàn)隨著As2O3的濃度和反應(yīng)時(shí)間上的不斷增加，端粒酶的活性不斷降低。因此推斷As2O3能抑制乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性在時(shí)間－濃度均呈依賴性，這為As2O3在治療乳腺癌的實(shí)踐中提供理論依據(jù)。

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