牙髓干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

鄭 偉 劉朋飛 馮業(yè)童 董 超 周余來(lái) (通化市口腔醫(yī)院，吉林 通化 34000)

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和一定分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種具有不同功能的細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段及其功能學(xué)特性，可將其進(jìn)一步分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。因此，干細(xì)胞在組織工程、再生醫(yī)學(xué)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，牙齒缺損等牙源性疾病在中老年人中發(fā)病率較高。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cell，DPSC)是牙髓組織中的一類成體干細(xì)胞，具有一定的分化潛能和增殖能力，在牙齒再生、牙髓修復(fù)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值，特別是隨著相關(guān)組織工程技術(shù)的發(fā)展，DPSC具備了成為一種新型種子細(xì)胞的潛能〔1〕。

1 DPSC的定義和基本生物學(xué)性質(zhì)

成牙本質(zhì)細(xì)胞是一種終末細(xì)胞，不具備進(jìn)一步分化的能力，因此，一般認(rèn)為成牙本質(zhì)細(xì)胞在遭受損傷后，牙髓內(nèi)的某些具有分化功能的前體細(xì)胞可進(jìn)一步分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并分泌相關(guān)細(xì)胞基質(zhì)，修復(fù)受損組織，這種前體細(xì)胞即為DPSC。DPSC具有較強(qiáng)的增殖能力和較高的分化潛能，正是這兩種生物學(xué)性質(zhì)，決定了DPSC在牙源組織修復(fù)和骨性修復(fù)方面具有重要的作用〔2〕。

Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓內(nèi)可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細(xì)胞命名為DPSC，研究人員應(yīng)用酶消化法對(duì)成人第三磨牙的牙髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：這兩種細(xì)胞具有極為相似的免疫學(xué)特性，并且，該研究進(jìn)一步證實(shí)DPSC經(jīng)體外誘導(dǎo)后，可形成高密度的鈣化小結(jié)，將DPSC與羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)支架復(fù)合后移植到小鼠背側(cè)皮下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，能觀察到類似于牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣的結(jié)構(gòu)。

2 DPSC的多向分化潛能

作為一種成體干細(xì)胞，DPSC具備多向分化的潛能，這種潛能不僅僅局限在骨性分化方面，研究人員在成脂分化、神經(jīng)分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著重要的指導(dǎo)意義。

2.1 DPSC的骨性分化 DPSC的骨性分化是關(guān)于DPSC定向分化研究較早的一項(xiàng)內(nèi)容，近些年來(lái)，又有了進(jìn)一步的發(fā)展。Mori等〔4〕采用成骨分化培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)DPSC的骨性誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些典型成骨細(xì)胞基因，如：堿性磷酸酶、I型膠原、骨橋蛋白等均大量表達(dá);應(yīng)用微陣列及RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過(guò)程中，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受體相關(guān)基因(NURR1)均發(fā)生表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，這一機(jī)制在成骨分化過(guò)程中有著重要的意義。D'Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨誘導(dǎo)過(guò)程中，加入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，結(jié)果顯示：這種方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促進(jìn)了成骨分化的進(jìn)程。

2.2 DPSC的神經(jīng)分化 DPSC來(lái)源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)脊，在神經(jīng)分化方面具備一定的潛能。Király等〔6〕采用低溫?fù)p傷的方法制備3日齡Wistar大鼠腦缺損模型，于顱內(nèi)注入DPSC進(jìn)行修復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)：DPSC趨向分布于室下區(qū)、胼胝體下區(qū)等神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞區(qū)，并表達(dá)微管蛋白(N-tubulin)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志，對(duì)損傷部位有一定的修復(fù)作用，并且具有神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的電壓依從性。因此，該結(jié)果進(jìn)一步顯示，DPSC在腦損傷體內(nèi)修復(fù)方面，可以作為一種有效的修復(fù)細(xì)胞。Kara?z等〔7〕研究表明：DPSC不僅可以分化為神經(jīng)干細(xì)胞，而且在分化能力方面，高于傳統(tǒng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.3 DPSC的成脂分化 除成骨分化、神經(jīng)分化方面，成脂分化也是DPSC的一項(xiàng)重要潛能。Nozaki等〔8〕于成脂培養(yǎng)基中加入胰島素、地塞米松等誘導(dǎo)成脂，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的作用，可見(jiàn)細(xì)胞中有脂滴的形成，并且在分化過(guò)程中多能性標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，Nanog基因無(wú)顯著變化;通過(guò)基因微陣列分析，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：過(guò)氧化物酶體增生物激活受體信號(hào)通路的多種組分，均發(fā)生變化。所以，對(duì)這些基因的調(diào)控，在細(xì)胞成脂分化過(guò)程中有著重要意義。

3 DPSC的分化誘導(dǎo)因素

在細(xì)胞分化的過(guò)程中，分化方向、分化程度、分化速度均會(huì)受到一系列物化因素、生物因素的影響，協(xié)調(diào)各方面因素對(duì)控制細(xì)胞定向分化有著重要意義。Ito等〔9〕將犬類的DPSC與不同的支架材料相結(jié)合，并用這種結(jié)合物治療骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的支架材料，修復(fù)效果會(huì)有較大差異，其中DPSC/富血小板血漿(PRP)復(fù)合物具備較好的修復(fù)效果。Galler等〔10〕將DPSC接種于水凝膠支架上，并將復(fù)合物移植到經(jīng)過(guò)次氯酸鈉(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)處理過(guò)的牙本質(zhì)內(nèi)部，培養(yǎng)6 w后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)NaClO處理的牙本質(zhì)與復(fù)合物結(jié)合較好，接觸面形成大量細(xì)胞陷窩;經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)處理的牙本質(zhì)可以誘導(dǎo)進(jìn)一步DPSC向成牙質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)一步表達(dá)牙本質(zhì)涎蛋白，提高牙本質(zhì)的修復(fù)速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC為研究對(duì)象，在常規(guī)成骨分化培養(yǎng)基中添加白細(xì)胞介素β(IL-1β)，結(jié)果顯示，細(xì)胞的骨唾液蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白等礦化物質(zhì)的表達(dá)均上調(diào)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到了相似結(jié)果，可見(jiàn)，IL-1β在成骨礦化過(guò)程中有一定的促進(jìn)作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白在誘導(dǎo)成骨方面有著重要作用，Liu等〔12〕分離擴(kuò)增家兔DPSC后，將這種種子細(xì)胞接種在羥基磷灰石、膠原等支架材料上，并用骨形態(tài)發(fā)生蛋白II進(jìn)行刺激處理，結(jié)果成骨速度明顯提高，最后制備的復(fù)合物更有利于體內(nèi)移植和組織修復(fù)。

4 DPSC的重編程與再分化

2006 年，Takahashi等〔13〕將4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)導(dǎo)入已處于終末分化狀態(tài)的小鼠成纖維細(xì)胞中，從而獲得了一種類似于胚胎干細(xì)胞的多能性細(xì)胞，稱為“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。這種方法可以非常穩(wěn)定的制造多能干細(xì)胞，引起了極大的關(guān)注。繼此之后，人類體細(xì)胞被成功誘導(dǎo)為iPS的報(bào)道〔14〕和老年人皮膚成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞亞群的報(bào)道〔15〕相繼出現(xiàn)，這種細(xì)胞被認(rèn)為是一種極具前景的干細(xì)胞。體細(xì)胞通過(guò)一定誘導(dǎo)方式，轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞亞群的過(guò)程稱為“重編程”;iPS經(jīng)過(guò)定向誘導(dǎo)，再次分化為其他種類細(xì)胞的過(guò)程，稱為“再分化”。

DPSC作為一種可以快速自我更新的成體干細(xì)胞，同樣具備重編程和再分化的潛能。Yan等〔16〕采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法，將4個(gè)因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)導(dǎo)入DPSC中，將DPSC重編程為iPS細(xì)胞亞群。DPSC來(lái)源的iPS細(xì)胞亞群表達(dá)階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面標(biāo)記，具備多向分化的潛能，可分化成3個(gè)胚層的組織，而且可被定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元。Tamaoki等〔17〕對(duì)多株DPSC進(jìn)行重編程誘導(dǎo)，結(jié)果顯示不同株的DPSC在重編程效率方面會(huì)有很大差別，不同株DPSC來(lái)源的iPS細(xì)胞亞群的再分化能力也有較大不同。因此，建立一種高效安全的重編程模式和再分化方法，仍是干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

5 展望

在口腔醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，DPSC的分離提取較為方便，常?？梢酝ㄟ^(guò)分離某些牙源廢物的髓質(zhì)成分獲得。因此，該細(xì)胞在分離培養(yǎng)方面的便宜性以及本身具有的多向分化潛能、自我更新能力，均在很大程度上決定了該細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用前景。但是，關(guān)于DPSC諸多方面的研究尚處于起步階段，特別是在體內(nèi)應(yīng)用性研究方面，仍需進(jìn)一步探索。所以，只有建立一種高效穩(wěn)定、安全可靠的DPSC的應(yīng)用模式，這種成體干細(xì)胞才能真正走進(jìn)臨床，服務(wù)于人類。

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