凝血酶在動脈粥樣硬化形成中的作用

孟慶華 朱金墻 John Orgah 張 萌 (天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 30093)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展共同病理基礎(chǔ)，是一種慢性炎性反應(yīng)過程。凝血酶能通過受體和非受體途徑激活血小板，參與凝血和血栓形成，促進(jìn)血管壁非細(xì)胞成分的累積、血管內(nèi)膜合成以及釋放炎癥反應(yīng)因子，調(diào)節(jié)血漿白細(xì)胞及血管壁細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等均有廣泛的影響，在AS形成中發(fā)揮重要作用。

1 凝血酶及其受體

凝血酶是一種專一性很強(qiáng)的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，能直接作用于血液中的纖維蛋白原，催化其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，促進(jìn)血液凝塊形成。凝血酶不僅是凝血因子，還是重要的促炎癥因子、生長調(diào)節(jié)蛋白，參與體內(nèi)一系列生理病理過程，如止血、凝血、炎癥、免疫、組織修復(fù)、創(chuàng)傷愈合等〔1～3〕。

凝血酶受體是一種蛋白酶活化受體(PAR)，屬G-蛋白耦聯(lián)受體家族成員，人體含有4種PARs亞型，廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血小板、成纖維細(xì)胞以及某些淋巴細(xì)胞中〔4〕。其中，PAR-1、PAR-3、PAR-4 可被凝血酶激活，PAR-2 可被胰蛋白酶或類胰蛋白酶激活。PAR-1在凝血酶介導(dǎo)的血小板激活中起著最主要的作用〔5〕;PAR-4為血小板活化和炎癥的強(qiáng)力調(diào)節(jié)受體，可調(diào)節(jié)疼痛反應(yīng)〔6，7〕。凝血酶許多生物活性均由PAR介導(dǎo)。

凝血酶與受體結(jié)合后，通過蛋白分解作用切割細(xì)胞外域氨基酸末端，產(chǎn)生新的N末端序列，使凝血酶受體與配體結(jié)合，從而激活受體，產(chǎn)生跨膜信號，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子活動和蛋白磷酸化，產(chǎn)生一系列效應(yīng)。

2 凝血酶在AS形成過程中的作用

2.1 影響內(nèi)皮細(xì)胞功能 血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有屏障作用，還是重要的分泌代謝器官，具廣泛生物活性，可通過合成并分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)血管張力、維持血液流動、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、參與免疫應(yīng)答，并協(xié)同血管平滑肌參與血管重構(gòu)，維持血管正常的生理功能。凝血酶通過凝血酶受體及非受體途徑對血管壁產(chǎn)生重大影響，引起內(nèi)皮功能障礙。

2.1.1 凝血酶增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性 陳志斌等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血凝塊產(chǎn)生的凝血酶通過激活PAR-1造成內(nèi)皮細(xì)胞收縮，引起通透性增加，破壞血腦屏障。凝血酶能使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMVEC)的細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞收縮，間隙增寬，通透性增加，促進(jìn)腦水腫形成。體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中加入不同濃度(0、0.1、10、12.5、25、50、100 U/ml)凝血酶后，培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量呈劑量依賴性升高，提示隨著凝血酶濃度的升高，HUVEC通透性增強(qiáng)。凝血酶作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使細(xì)胞內(nèi)RhoA激酶活化，引起F-肌動蛋白重構(gòu)，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，屏障功能受損，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加〔9〕。

2.1.2 凝血酶上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體 Tsopanoglou等〔10〕觀察到凝血酶與體外培養(yǎng)的HUVEC共同溫育可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并證實凝血酶經(jīng)PKC和MAPK信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體表達(dá)。VEGF是促血管生長因子和血管通透因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖〔11，12〕，促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集和單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向炎癥的趨向性〔13〕。Verheul等〔14〕研究了原發(fā)性腎細(xì)胞癌腫瘤組織中VEGF與凝血標(biāo)志物之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VEGF與纖溶系統(tǒng)密切相關(guān)。VEGF可以進(jìn)一步活化尿激酶型纖溶酶原激活物受體、組織因子等與凝血相關(guān)的因子〔15〕，使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，使血液處于高凝狀態(tài)，增加血栓形成風(fēng)險。

2.1.3 凝血酶促進(jìn)血管內(nèi)皮釋放細(xì)胞外基質(zhì)降解酶 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解廣泛存在的細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白及蛋白多糖)的酶類總稱。細(xì)胞外基質(zhì)合成或降解代謝失衡在AS形成中具重要意義，MMP-2的表達(dá)量隨動脈粥樣硬化程度的加重而升高，其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解是動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定的重要因素，被認(rèn)為是治療AS及防治并發(fā)癥的靶分子〔16〕。

凝血酶與MMP-2在AS發(fā)展過程中呈相互正反饋作用。MMP-2能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，降解明膠、多種膠原、基底膜成分，加速AS斑塊的破裂，斑塊急性破裂在損傷血管局部產(chǎn)生新的凝血酶，凝血酶又促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放MMP-2，并激活MMP-2，活化的MMP-2降解基質(zhì)促使斑塊內(nèi)血栓溶解和出血，最終導(dǎo)致硬化斑塊的不穩(wěn)定〔17〕。

Lafleur等〔18〕證明，凝血酶活化MMP-2是通過膜型 MMP介導(dǎo)而非經(jīng)典的凝血酶受體途徑。Pekovich等〔19〕認(rèn)為凝血酶對內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2的釋放是由PKC介導(dǎo)，血栓調(diào)節(jié)素加強(qiáng)了該作用。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)中上調(diào)的MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)，其信號通路與ERK1/2及PKC有關(guān)，特別是PKCα/β〔20〕。PKC抑制劑燈盞花素可以下調(diào)凝血酶誘導(dǎo)的HUVEC中MMP-2表達(dá)，但PKC抑制劑只能部分抑制MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)，而抑制ERK1/2及PKC幾乎可以完全抑制MMP-2 表達(dá)〔21〕。

2.1.4 凝血酶促進(jìn)血管內(nèi)皮炎癥因子表達(dá) 凝血酶通過PAR-1、PAR-4介導(dǎo)細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)釋放〔22〕，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞多種黏附因子的表達(dá)〔23〕，如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1等，促進(jìn)白細(xì)胞的活化及其與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，增強(qiáng)白細(xì)胞穿透內(nèi)皮的能力，介導(dǎo)血管外壁細(xì)胞的遷移，損傷血管，促進(jìn)AS形成。

凝血酶誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的機(jī)制與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)有關(guān)。關(guān)景霞等〔24〕觀察到腦內(nèi)注射凝血酶后，NF-κB活性增強(qiáng)，加入PAR1抑制劑CATG后，NF-κB激活被抑制。黃承芳等〔25〕認(rèn)為凝血酶誘導(dǎo)的炎癥變性反應(yīng)還與JAK2-STAT3信號途徑有關(guān)，JAK-STAT信號途徑抑制劑可減輕凝血酶介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.1.5 凝血酶促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 內(nèi)皮功能受損是AS早期事件的始動環(huán)節(jié)，該損傷很可能是細(xì)胞凋亡增高所致〔26〕。凝血酶能誘導(dǎo)BMVEC凋亡，且存在一定的劑量依賴關(guān)系，使用凝血酶特異性受體PAR阻斷劑水蛭素后，BMVEC凋亡受到明顯抑制，表明凝血酶的促凋亡作用依賴于PAR受體的激活〔27〕。大劑量凝血酶與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性在其他組織中已有報道〔28，29〕。陳志斌等〔8〕研究結(jié)果顯示腦內(nèi)注射凝血酶 6 h后，Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，表明凝血酶是凋亡發(fā)生的重要物質(zhì);加入PAR-1抑制劑CATG后，可抑制腦內(nèi)注射凝血酶后Caspase-3的激活，表明凝血酶可通過 PAR-1受體激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2.2 凝血酶對血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的影響 VSMCs異常增生遷移在AS發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用〔30〕。方正旭等〔31〕研究發(fā)現(xiàn)0.5、1 U/ml凝血酶作用于體外培養(yǎng)的 VSMCs，在0、1、6、12、24、48、72 h 各時間段均有促增殖作用。Sacks等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)凝血酶作用于VSMCs后引起細(xì)胞收縮及增殖與細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為凝血酶通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血小板源性生長因子(PDGF)-B而發(fā)揮有絲分裂作用，促進(jìn) VSMCs增生〔12，33〕。凝血酶作為絲裂原促 VSMCs增殖信號傳導(dǎo)過程已成為近年來研究者關(guān)注的熱點，目前研究認(rèn)為其機(jī)制復(fù)雜，除具有G蛋白耦聯(lián)受體途徑使細(xì)胞迅速進(jìn)入S期外〔34〕，還與JAK信號途徑有關(guān)。有實驗證實凝血酶可增加Jak2的活性〔35〕，Jak可介導(dǎo)早期生長應(yīng)答基因 c-fos、c-jun mRNA表達(dá)，引起 VSMCs增殖。此外，凝血酶可誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)pp60c-src激活〔31〕，pp60c-src是典型的非受體 PTK，可使 Ras和PLC-γ1等多種蛋白酪氨酸磷酸化而激活，從而廣泛參與促細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。曾慧青等〔36〕研究了新信號通路STAT-5B/HSP27/FGF-2在凝血酶誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移中的作用，驗證了STAT-5參與凝血酶誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移。近期研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶通過PAR-1的蛋白水解激活，從而促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖，加入凝血酶抑制劑阿加曲班后，凝血酶的作用被抑制，失去了刺激細(xì)胞增殖的功能〔37〕，表明凝血酶促細(xì)胞增殖作用與PAR有關(guān)。

2.3 凝血酶對血管收縮的影響 張倩等〔38〕采用離體灌流血管環(huán)的方法，觀察了凝血酶及其受體激動劑對大鼠離體胸主動脈和肺動脈的作用，并與體循環(huán)血管進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)凝血酶及PAR-1激動劑可誘導(dǎo)胸主動脈和肺動脈的收縮。然而，凝血酶及其受體激動劑誘導(dǎo)血管收縮的機(jī)制與腎上腺、去甲腎上腺素及苯腎上腺素不同，其平滑肌細(xì)胞收縮時鈣的來源可能主要依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，而非外鈣內(nèi)流。凝血酶可能通過作用于其受體而發(fā)揮縮血管作用，其中PAR-1、PAR-4主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對血管張力起調(diào)控作用。而凝血酶對VSMCs收縮主要是由PAR-1介導(dǎo)〔39〕。生理條件下，凝血酶的細(xì)胞學(xué)作用主要通過內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)，而在病理生理條件下，平滑肌細(xì)胞上的PARs則作用更明顯。

2.4 凝血酶對血小板的影響 凝血酶可活化血小板使之發(fā)生聚集。陳小萍等〔40〕以凝血酶為誘導(dǎo)劑，采用熒光倒置顯微鏡觀察田七總皂甙對凝血酶誘導(dǎo)的兔血小板聚集的影響。鏡下觀察到加入凝血酶的血小板黏連成一片，發(fā)生聚集;加入田七總皂甙作用后，隨著藥物濃度的增加，血小板逐漸松散，凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集黏連作用被顯著抑制。

凝血酶通過血小板表面PAR-1與PAR-4受體激活血小板，PAR-1或PAR-4模擬肽都足以誘導(dǎo)人血小板活化，并通過G蛋白發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用〔5〕。凝血酶激活血小板后使其具有與細(xì)胞黏附性蛋白結(jié)合的活性，可形成牢固的黏附和聚集塊，導(dǎo)致血栓形成。過度激活的血小板不僅介導(dǎo)血小板聚集，還能激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)粥樣斑塊的形成，是AS形成過程中不可忽視的環(huán)節(jié)之一〔41〕。由PAR-1介導(dǎo)的血小板活化途徑主要在病理性血栓形成過程發(fā)揮作用。PAR-1受體抑制劑可阻斷凝血酶介導(dǎo)的血小板激活而不影響凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白原裂解，據(jù)此而研發(fā)的藥物SCH-530348，應(yīng)用于臨床可降低缺血性事件發(fā)生風(fēng)險的概率，而不會明顯增加機(jī)體出血的風(fēng)險，已用于急性冠脈綜合征的治療和缺血性心血管事件的預(yù)防〔42〕。

2.5 凝血酶對凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體的影響 植物凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX-1)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs、巨噬細(xì)胞、血小板和成纖維細(xì)胞中，介導(dǎo)氧化型低密度脂蛋白的攝入，參與巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂、VSMCs凋亡，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展〔43〕。

凝血酶可通過表皮生長因子受體誘導(dǎo)LOX-1表達(dá)增加。蘇琳等〔44〕研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的牛主動脈平滑肌細(xì)胞中加入凝血酶及凝血因子Xa刺激后，LOX-1表達(dá)明顯增加，表皮生長因子受體相關(guān)酪氨酸激酶抑制劑AG1478可顯著抑制該作用。

2.6 凝血酶對凝血-纖溶系統(tǒng)的影響 AS的發(fā)生發(fā)展與凝血-纖溶調(diào)節(jié)系統(tǒng)密切相關(guān)。凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)作為凝血和纖溶的聯(lián)系紐帶，發(fā)揮抑制纖溶的作用，參與了AS的發(fā)生發(fā)展，其活性升高可能是AS的致病因素之一〔45〕。

血凝塊形成后，凝血酶的激活會形成正反饋，其濃度不斷升高，高濃度的凝血酶可活化TAFI;此外，血管壁損傷時釋放血栓調(diào)節(jié)蛋白，與凝血酶形成凝血酶——凝血酶調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體，能使TAFI的激活效率提高1 250倍〔46〕。TAFI水平升高，下調(diào)纖溶，從而促進(jìn)AS的發(fā)展。

機(jī)體內(nèi)凝血系統(tǒng)一經(jīng)激活，凝血酶即可使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，不僅能直接損傷血管壁，刺激VSMCs增生和遷移，引起血管內(nèi)皮功能異常，而且可直接激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)黏附分子表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)〔47〕，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓性發(fā)生變化，凝血系統(tǒng)活性增加，纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性降低，血管性血友病因子、TAFI、組織因子等促凝活性物質(zhì)過度激活，血液處于高凝狀態(tài)，增加血栓形成的危險，從而促進(jìn)AS形成。

3 結(jié)語

AS形成是一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞改變的總結(jié)果，在這個慢性炎性反應(yīng)的過程中，多種炎性細(xì)胞、血管細(xì)胞以及細(xì)胞因子相互作用，形成一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致AS形成。凝血酶通過受體非受體途徑參與多個環(huán)節(jié)，影響內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板等的正常生理功能，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)浸潤和血栓形成，加速AS進(jìn)程。

凝血酶生物學(xué)效應(yīng)的多樣性不僅因為其受體的多樣性，還在于凝血酶受體介導(dǎo)豐富的細(xì)胞間信號網(wǎng)絡(luò)與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用。VSMCs、動脈內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞表面均有凝血酶受體存在。明確凝血酶在AS中的作用途徑及其具體作用機(jī)制，并針對性地對凝血酶激活導(dǎo)致的病理環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，將為臨床防治AS提供新的思路，并為有效的藥物治療提供理論依據(jù)。如最新研制的新藥喜巴辛衍生物SCH-530348即是針對凝血酶受體PAR-1的抑制劑，能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集而不影響凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白原裂解，既有抗血栓的作用又不會增加出血風(fēng)險的理想藥物〔43〕。

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