抗巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌藥物微球制劑的研究進(jìn)展

郭振勇，劉 碩，靳海龍（北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149）

抗巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌藥物微球制劑的研究進(jìn)展

郭振勇＊，劉 碩，靳海龍（北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149）

目的：為抗巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌藥物微球制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。方法：根據(jù)文獻(xiàn)，綜述了幾種處于研究階段的不易進(jìn)出巨噬細(xì)胞的抗結(jié)核菌藥物（利福平、莫西沙星、氧氟沙星等）所制微球制劑的研究進(jìn)展。結(jié)果與結(jié)論：這幾種微球制劑具有較其普通藥物更強(qiáng)的抗結(jié)核菌作用?？梢?jiàn)微球作為藥物載體，對(duì)攜帶藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞、快速殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌提供了一條可行的道路。

結(jié)核病；巨噬細(xì)胞；微球；研究進(jìn)展

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所致，為當(dāng)今世界三大傳染性疾病之一，全球有1/3的人口感染過(guò)結(jié)核病。平均每年新增加800萬(wàn)感染患者，并有大約300萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。巨噬細(xì)胞是廣泛存在于人體各種組織的細(xì)胞群，是人體免疫系統(tǒng)的一部分，它通常能夠吞噬外來(lái)致病原，并利用其核內(nèi)體或溶酶體對(duì)病原體進(jìn)行消化處理，形成食物泡，最終將之降解。結(jié)核桿菌主要通過(guò)巨噬細(xì)胞表面受體C3以及CR1、CR3、CR4等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用而侵入巨噬細(xì)胞，一旦進(jìn)入后，能夠抑制食物泡的成熟，從而逃過(guò)巨噬細(xì)胞的降解，進(jìn)而導(dǎo)致人體發(fā)病[1]。

在過(guò)去30年中，還沒(méi)有一種具有全新結(jié)構(gòu)或全新作用機(jī)制的抗結(jié)核菌藥物上市，雖然最近幾年人們加大了研制抗結(jié)核菌藥物的投入，但是研制出的新藥不多。目前臨床上所用的抗結(jié)核菌藥物仍然是幾十年前開(kāi)發(fā)的，并且隨著結(jié)核桿菌耐藥情況的日益加重，許多藥物的抗菌效果不斷下降。另外，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的治療結(jié)核病的療程為6～9個(gè)月，有的患者可能需要更長(zhǎng)療程，這就使得患者的用藥依從性差，而依從性差不但使得患者的療程更長(zhǎng)，更嚴(yán)重的是可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使疾病發(fā)展成為耐藥性結(jié)核，更加難以治愈。這就迫使人們?cè)陂_(kāi)發(fā)新藥的同時(shí)，對(duì)現(xiàn)在應(yīng)用的抗結(jié)核菌藥物進(jìn)行劑型改造，以期解決目前這種危急狀況，其中對(duì)于攜帶抗結(jié)核菌藥物微球和納米粒制劑的研究是一個(gè)重點(diǎn)。本文根據(jù)文獻(xiàn)，綜述了抗巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌藥物微球制劑的研究進(jìn)展情況，現(xiàn)介紹如下。

1 抗巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌藥物微球制劑的優(yōu)點(diǎn)

導(dǎo)致結(jié)核病久治不愈的主要原因之一就是結(jié)核菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，將巨噬細(xì)胞作為宿主，并在其中存活、生長(zhǎng)。而要想殺死這些細(xì)菌，抗結(jié)核菌藥物必須能滲透入巨噬細(xì)胞，并達(dá)到足夠的量，才能有效地殺滅這些細(xì)菌。莫西沙星、氧氟沙星對(duì)培養(yǎng)基中結(jié)核菌H37Rv的最小抑菌濃度（MIC）均為0.5mg·L－1，而對(duì)J774A.1（巨噬細(xì)胞編號(hào)）小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的MIC分別為1.0、2.0mg·L－1，后者是前者的2～4倍[2]。導(dǎo)致這種結(jié)果出現(xiàn)的原因至少可部分解釋為二者滲透進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力有差異，所以在某種程度上可以說(shuō)巨噬細(xì)胞為結(jié)核桿菌提供了一個(gè)保護(hù)作用。

微球制劑的出現(xiàn)為解決這一問(wèn)題提供了有效的途徑。目前制作微球一般采用的生物可降解材料如聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、羥基乙酸共聚物（PGA）、乳酸共聚物（PLA）等，微球進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，主要集聚在吞噬溶酶體內(nèi)，然后降解[3]并將其攜帶的藥物釋放出來(lái)，發(fā)揮抗結(jié)核作用。經(jīng)過(guò)這樣處理的藥物往往能主動(dòng)地被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬，在巨噬細(xì)胞中聚集，產(chǎn)生高于MIC幾倍甚至幾十倍的藥物濃度[4]，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的藥物敏感性結(jié)核桿菌、甚至耐藥性結(jié)核桿菌起到殺滅作用。另外，藥物從微球或納米粒中的釋放可以達(dá)數(shù)天[5]，這對(duì)減少抗結(jié)核菌藥物給藥次數(shù)、解決治療結(jié)核病的另外一個(gè)難題即提高患者的用藥依從性提供了可能。

微球的另一個(gè)特性就是其粒徑較小，使其可以用于肺部吸入給藥。研究[6，7]表明，微球經(jīng)肺部吸入后，與原料藥相比，一方面使得支氣管巨噬細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加了30多倍，另一方面這種局部給藥的方式可以降低血及肝臟中藥物的濃度，從而降低了藥物的全身不良反應(yīng)，尤其是肝臟毒性。

2 幾種抗結(jié)核菌藥物微球制劑的研究進(jìn)展

常用于抗結(jié)核菌的藥物中有部分可以自由進(jìn)出巨噬細(xì)胞，如異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等，其他藥物如利福平、氧氟沙星、莫西沙星、卡介菌、重組結(jié)核菌抗原等一些藥物不易進(jìn)出巨噬細(xì)胞，所以現(xiàn)在的研究主要集中在后幾類(lèi)藥品。這幾種藥物的微球制劑雖然目前還沒(méi)有上市，但是前期研究已表明其對(duì)于攜帶藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞前景較好，將其進(jìn)展情況介紹如下。

2.1 利福平微球

利福平是當(dāng)前臨床抗結(jié)核菌病的一線用藥，殺菌作用強(qiáng)，在液體培養(yǎng)基中對(duì)結(jié)核菌H37Rv的MIC達(dá)到0.05～0.1μg·mL－1，在固體培養(yǎng)基中為0.25μg·mL－1，可以滲透進(jìn)入巨噬細(xì)胞而發(fā)揮殺菌作用。但是隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，利福平的耐藥情況不斷惡化。在2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)的抽樣調(diào)查中顯示，我國(guó)利福平的耐藥率達(dá)到30%[8]。為增強(qiáng)利福平的殺菌作用，同時(shí)也為了克服細(xì)菌對(duì)利福平的耐藥問(wèn)題，有必要對(duì)利福平進(jìn)行制劑改造，以提高利福平滲透進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力。

2.1.1 利福平微球的直徑對(duì)于巨噬細(xì)胞攝入微球量的影響[4，9]。有研究[4]利用微球技術(shù)將利福平包裹起來(lái)，以期提高進(jìn)入巨噬細(xì)胞的藥物含量，并對(duì)微球的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了攜帶藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞最適合的條件，認(rèn)為微球的直徑對(duì)于提高支氣管巨噬細(xì)胞吞噬微球的能力起決定作用；而制備微球材料的分子量及其在微球中所占的比例則相對(duì)影響較小，但后二者對(duì)于微球攜帶利福平的效率和藥物在巨噬細(xì)胞內(nèi)從微球的釋放起關(guān)鍵作用。研究結(jié)果表明，直徑為3.5μm的微球進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力最強(qiáng)，有80%的巨噬細(xì)胞吞噬了微球；而直徑為6～10μm的微球，只有40%～60%的巨噬細(xì)胞吞噬了微球。這與Hirota等[10]的研究結(jié)果類(lèi)似。當(dāng)細(xì)胞個(gè)數(shù)與微球的數(shù)量比例一定時(shí)，吞噬直徑為3μm微球的巨噬細(xì)胞的數(shù)量是吞噬直徑為6～10μm微球的細(xì)胞個(gè)數(shù)的3倍。但二者的研究[4，10]結(jié)果有所不同，Hirota等研究中吞噬直徑為1μm微球細(xì)胞個(gè)數(shù)大于吞噬直徑為3μm微球的細(xì)胞個(gè)數(shù)，說(shuō)明微球直徑越小，越容易被吞噬。但由于直徑3μm的微球攜帶藥物的量較大，并且能夠進(jìn)入大部分巨噬細(xì)胞，所以選擇直徑3μm的微球?yàn)樽罴褩l件。這類(lèi)微球適宜于肺部直接噴霧給藥，可以起到局部用藥在局部產(chǎn)生較高濃度的效果。

2.1.2 利福平微球的體外殺菌效果[4]。按照上述條件制備的微球（利福平含量為14mg·L－1）與巨噬細(xì)胞共同孵化4h后，測(cè)得巨噬細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度為3.5mg·L－1，此濃度是對(duì)利福平敏感的結(jié)核桿菌MIC的70倍，而普通利福平進(jìn)入巨噬細(xì)胞的量幾乎檢測(cè)不到。Hirota等[11]的研究結(jié)果類(lèi)似，分別將2.5mg·L－1的利福平微球和5μg·mL－1的利福平溶液與巨噬細(xì)胞共同孵化7d后，前者所得巨噬細(xì)胞內(nèi)利福平的含量反而是后者的10倍。

在一項(xiàng)考察體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞內(nèi)殺菌效果的研究中表明，相同劑量的利福平微球（按利福平計(jì)算14mg·L－1）7d時(shí)能清除90%的結(jié)核菌，14d時(shí)的細(xì)菌清除率達(dá)到99%，而利福平溶液殺菌效果不明顯；只有當(dāng)利福平溶液濃度為100mg·L－1時(shí)能清除90%的細(xì)菌，表明利福平溶液對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的殺菌效果僅為利福平微球的10%。

2.1.3 利福平微球的體內(nèi)殺菌活性。Yoshida等[4]的研究結(jié)果表明，利福平微球的體內(nèi)活性與利福平溶液相比，雖然可降低肺內(nèi)活菌計(jì)數(shù)，但并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與給藥方式有關(guān)，研究者采用噴霧的方式給藥，由于直徑3μm的藥物微球顆粒太小，極易隨氣體呼出體外所致。而Suarez等[12]用氣管插管的方式分別給予利福平微球和利福平溶液發(fā)現(xiàn)，利福平微球與利福平溶液組相比，肺內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)顯示有明顯差異。

2.2 莫西沙星微球

莫西沙星是最近應(yīng)用于臨床的抗耐藥結(jié)核菌藥物，是喹諾酮類(lèi)藥物中抗結(jié)核作用最強(qiáng)的，其殺菌作用幾乎等同于利福平。但是莫西沙星只能部分進(jìn)入巨噬細(xì)胞[2]，為了增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核作用并減少給藥次數(shù)，Kisich等[13]對(duì)攜帶莫西沙星微球（PBCA-MOX）的療效進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，PBCAMOX在巨噬細(xì)胞中聚集的量幾乎是莫西沙星溶液的3倍，對(duì)于結(jié)核菌的MIC比莫西沙星溶液降低了10倍，并且在巨噬細(xì)胞中存在的時(shí)間長(zhǎng)6倍。由此可以看出，制作成微球后能提高莫西沙星巨噬細(xì)胞內(nèi)殺滅結(jié)核菌的能力，并且能達(dá)到一個(gè)緩釋作用。

2.3 氧氟沙星微球[14]

氧氟沙星是喹諾酮類(lèi)中最早用于治療耐藥性結(jié)核菌病（MDR-TB）的二線藥物，但與莫西沙星類(lèi)似，在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有大約50%的藥物能夠進(jìn)入巨噬細(xì)胞；當(dāng)以微球?yàn)檩d體時(shí)，巨噬細(xì)胞對(duì)氧氟沙星的攝入量提高了1.7～2.1倍。動(dòng)物體內(nèi)研究表明，與口服、靜脈給予氧氟沙星溶液相比，其藥-時(shí)曲線下面積（AUC）/90%菌株最低抑菌濃度（MIC90）分別增加了10.9和9.3倍。AUC/MIC90可代表喹諾酮類(lèi)藥物的殺菌效果，所以氧氟沙星制成微球制劑后，其抗結(jié)核菌的作用得到了明顯提高。

2.4 含多種藥物微球

由于抗結(jié)核菌病的治療需要多種藥物聯(lián)合使用，以減少耐藥的發(fā)生和提高療效，故有研究者將2種（異煙肼和利福平）或3種（異煙肼、利福平和乙胺丁醇）藥物同時(shí)包裹于微球中[15]。無(wú)論從藥物的AUC，還是體內(nèi)、外抗菌效果方面都得以較大提高，且不會(huì)增加藥物毒性[16]；而且即使降低微球中藥物劑量至常用劑量的2/3，其在動(dòng)物體內(nèi)的療效也沒(méi)有降低[17]。從這些微球的粒徑（平均為1.88μm）來(lái)看，其具備被巨噬細(xì)胞吞噬的條件，但這些微球是否能夠進(jìn)入巨噬細(xì)胞有待于進(jìn)一步證實(shí)。

2.5 卡介苗和重組結(jié)核菌抗原微球

在結(jié)核病的預(yù)防和治療中，卡介苗和重組結(jié)核菌抗原占有重要的地位，經(jīng)非口服給藥后，其可能通過(guò)刺激人體免疫系統(tǒng)降低肺部細(xì)菌量以及減輕肺部病變[18]。但是這些疫苗屬于蛋白類(lèi)物質(zhì)，在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)極易受到體內(nèi)一些酶及巨噬細(xì)胞破壞，所以如果能經(jīng)肺部給藥，一方面可以直接到達(dá)作用部位，減少破壞；另一方面，肺部是結(jié)核桿菌感染的基本部位，肺部巨噬細(xì)胞是結(jié)核桿菌的第1個(gè)宿主[19]，故肺部給藥將能較好地發(fā)揮這類(lèi)藥物的作用。

將重組結(jié)核菌抗原TB10.4-Ag85B包裹進(jìn)入微球后，經(jīng)噴霧給藥，與原溶液相比更能刺激T淋巴細(xì)胞分泌白介素2[20]，顯示其更好地刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的能力。

3 結(jié)語(yǔ)

目前結(jié)核病的治療對(duì)醫(yī)務(wù)工作者而言依然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，尤其是當(dāng)結(jié)核菌“躲入”巨噬細(xì)胞內(nèi)時(shí)可呈現(xiàn)出休眠狀態(tài)。這種休眠狀態(tài)的結(jié)核菌很難徹底清除，并可能導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。而微球制劑能夠增加藥物進(jìn)入巨噬細(xì)胞的量[21]，增強(qiáng)藥物的療效；并且這種制劑的緩釋特性，可以減少患者服藥次數(shù)，提高患者的用藥依從性，從而降低耐藥率的發(fā)生。故以微球?yàn)檩d體進(jìn)行抗結(jié)核菌藥物的輸送，為結(jié)核病的治療提供了一種較好的選擇。

[1] Vergne I，Chua J，Deretic V.Tuberculosis toxin blocking phagosome maturation inhibits a novel Ca2+/calmodulin-PI3K hVPSE34cascade[J].J Exp Med，2003，198（4）：653.

[2] Shandil RK，Jayaram R，Kaur P，et al.Moxifloxacin，ofloxacin，sparfloxacin and ciprofloxacin against mycobacterium tuberculosis：evaluation of in vitro and pharmacodynamics indices that best predict in vivo efficacy[J].Antimicrob Agents Chemther，2007，51（2）：576.

[3] Onoshita T，Shimizu Y，Yamaya N，et al.The behavior of PLGA microspheres containing rifampicin in alveolar macrophages[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2010，76（1）：151.

[4]Yoshida A，Matumoto M，Hshizume H，et al.Selective delivery of rifampicin incorporated into poly（DL-lactic-glycolic）acid microspheres after phagocytotic uptake by alveolar macrophages，and the killing effect against intracellular mycobacterium bovis Calmette-Guerin[J].Microbes Infect，2006，8（9-10）：2484.

[5] Zahoor A，Rajesh P，Sadhna S，et al.Novel chemotherapy for tuberculosis：chemotherapeutic potential of econazole-and moxifloxacin-loaded PLG nanoparticles[J].Int J Antimicrobial Agents，2008，31（2）：142.

[6] Takenaga M，Ohta Y，Tokura Y，et al.Lipid microsphere formulation containing rifampicin targets alveolar macrophages[J].Drug Dilivery，2008，15（3）：169.

[7] Pandey R，Sharma S，Khuller GK.Chemotherapy efficacy of nanoparticle encapsulated antituberculosis drugs[J].Drug Deliv，2006，13（4）：287.

[8] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查材料匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：3-4.

[9]Makino K，Nakajima T，Shikamura M，et al.Efficient intracellular delivery of rifampicin to alveolae macrophages using rifampicin-loaded PLGA micropheres：effects of molecular weight and composition of PLGA on release of rifampicin[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2004，36（1）：35.

[10] Hirota K，Hasegawa T，Hinata H，et al.Optimum conditionsforefficientphagocytosisofrifampicin-loaded PLGA microspheres by alveolar macrophages[J].J Control Release，2007，119（1）：69.

[11] Hirota K，Hasegawa T，Nakajima T，et al.Delivery of rifampicin-PLGA microspheres into alveolar macrophages is promising for treatment of tuberculosis[J].J Control Release，2010，142（3）：339.

[12] Suarez S，O’Hara P，Kazantseva M，et al.Respirable PLGA microspheres containing rifampicin for the treatment of tuberculosis：screening in an infectious disease model[J].Pharm Res，2001，18（9）：1315.

[13] Kisich KO，Gelperina S，Higgins MP，et al.Encapsulation of moxifloxacin within poly（butyl cyanoacrylate）nanoparticles enhances efficacy against intracellular Mycobacterium tuberculosis[J].Int J Pharm，2007，345（1-2）：154.

[14]Hwang SM，Kim DD，Chung SJ，et al.Delivery of ofloxacin to the lung and alveolar macrophages via hyaluronan microspheres for the treatment of tuberculosis[J].J Control Release，2008，129（2）：100.

[15] Pandey R，Sharma S，Khuller GK.Oral solid lipid nanoparticle-based antitubercular chemotherapy[J].Tuberculosis（Edinb），2005，85（5-6）：415.

[16] Pandey R，Sharma S，Khuller GK.Oral Poly（DL-lactideco-glycolide）nanoparticle based antituberculosis drug delivery：toxicological and chemotherapeutic implications[J].Indian J Exp Biol，2006，44（6）：459.

[17] Pandey R，Zahoor A，Sharma S，et al.Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against murine tuberculosis[J].Tuberculosis（Edinb），2003，83（6）：373.

[18] Garcia-Contreras L，Wong YL，Muttil P，et al.Immunization by a bacterial aerosol[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（12）：4656.

[19] Skeiky YA，Sadoff JC.Advances in tuberculosis vaccine strategies[J].Nat Rev Microbiol，2006，4（6）：469.

[20] Shi S，Hickey AJ.PLGA microparticles in respirable sizes enhance an in vitro T cell response to recombinant Mycobacterium tuberculosis antigen TB10.4-Ag85B[J].Pharm Res，2010，27（2）：350.

[21] Hirota K，Hasegawa T，Nakajima T，et al.Phagostimulatory effect of uptake of PLGA microspheres loaded with rifampicin on alveolar macrophages[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2011，87（2）：293.

R978.3

A

1001-0408（2012）33-3152-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.33

2011-09-22

2011-11-14）