大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物的工藝

雷雪，劉富崗，楊云

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008)

貫葉連翹Hypericum perforatum L.為藤黃科金絲桃屬的干燥地上部分［1］，其有效成分金絲桃素，具有明顯的抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤，以及顯著的抗DNA、RNA病毒作用，并可用于治療艾滋病［2-5］。大孔吸附樹脂為一種有機(jī)高聚吸附劑，具有選擇性好、吸附容量大、解析容易、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［6］。目前市場(chǎng)上的貫葉連翹提取物普遍存在金絲桃素量較低的現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了貫葉連翹藥材及其制劑的進(jìn)一步開發(fā)利用［7］。為了得到金絲桃素量較高的貫葉連翹提取物，且國(guó)內(nèi)外對(duì)貫葉連翹提取物的金絲桃素量應(yīng)不低于0.3%為指標(biāo)［8］，本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂的方法純化貫葉連翹提取物，以金絲桃素為指標(biāo)，對(duì)貫葉連翹提取物純化工藝進(jìn)行靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附-解吸研究，最終選取LSA－10型大孔吸附樹脂，并確定其最佳純化工藝。

1 儀器與試藥

BS210S型電子天平(北京賽多利斯公司);LC—20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);METTLER AE240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利公司)等。

貫葉連翹藥材購(gòu)于陜西渭南，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物貫葉連翹的干燥地上部分;金絲桃素對(duì)照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào):1158-080715);AB－8、S－8大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠);CAD－45、860021大孔吸附樹脂(山東魯抗股份有限公司);D101、DA－201大孔吸附樹脂(天津農(nóng)藥總廠);DB－301、HPD－600大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);LSA－10、LSA－20、XDA－6大孔吸附樹脂(西安藍(lán)深交換吸附材料有限責(zé)任公司);SP－825大孔吸附樹脂(日本三菱化學(xué)公司);色譜甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);雙蒸水;其余所用試劑的均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測(cè)定

2.1.1 色譜條件依利特Hypersil ODS2(5.0 mm×200mm，5 μm)［9］;檢測(cè)波長(zhǎng)590 nm;柱溫30℃;檢測(cè)器為SPD—20A UV/VIS;流動(dòng)相為甲醇-0.1 mol/L NaH2PO4(97∶3);體積流量1 mL/min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL進(jìn)樣，按2.1.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定，以金絲桃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為:A=298 457C－469.54，r=0.999 9(n=6)，金絲桃素質(zhì)量濃度在0.010 4～0.208 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 大孔吸附樹脂類型的選擇

2.2.1 上柱溶液的制備稱取貫葉連翹藥材粉末150 g，精密稱定，加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次3 h，乙醇提取液于50℃減壓濃縮至150 mL，即得。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法對(duì)大孔吸附樹脂進(jìn)行預(yù)處理［10］。

2.2.3 靜態(tài)篩選最佳大孔吸附樹脂分別稱取處理好的大孔吸附樹脂S－8、AB－8、CAD－45、860021、DB－301、D101、DA－201、HPD－600、LSA－10、LSA－20、XDA－6、SP－825各5 g，置100 mL錐形瓶中，備用。

在處理好的12種大孔吸附樹脂中，精密加入上柱溶液10 mL，振搖，靜置吸附24 h，精密吸取未吸附溶液，并蒸干，加甲醇溶解，HPLC法測(cè)定金絲桃素，并計(jì)算各型號(hào)樹脂靜態(tài)飽和吸附量，靜態(tài)飽和吸附量=(樣品中金絲桃素量－吸附后濾液中金絲桃素量)/樹脂量(mg/g干樹脂)［11］。

濾出已吸附上柱溶液大孔吸附樹脂，置于100 mL具篩三角瓶中，依次以30、20、10 mL的95%乙醇超聲洗滌，合并洗滌液，于85℃水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容，用HPLC法測(cè)定金絲桃素，計(jì)算12種樹脂的靜態(tài)洗脫率，靜態(tài)洗脫率=(洗脫液濃度×洗脫液體積)/飽和吸附量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，LSA－20、LSA－10、SP825、S－8、XDA－6 5種大孔吸附樹脂較其他類型的大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量與洗脫率均較高，其靜態(tài)飽和吸附量為XDA－6＞LSA－10＞S－8＞LSA－20＞SP－825＞1.35 mg/g，靜態(tài)洗脫率為L(zhǎng)SA－20＞LSA－10＞SP－825＞S－8＞XDA－6＞90%，所以選擇此5種大孔吸附樹脂對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)情況下上柱溶液的吸附與解吸附能力考察。

表1 大孔吸附樹脂靜態(tài)篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Static selection results of macroporous resins

2.2.4 動(dòng)態(tài)篩選最佳大孔吸附樹脂分別稱取處理好的LSA－10、LSA－20、S－8、SP825、XDA－6 5種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂各10 g，分別取上柱溶液40 mL上樣，控制體積流量為1 mL/min，預(yù)吸附2 h，過(guò)柱液重吸附一次，靜置12 h。收集過(guò)柱液，然后用蒸餾水洗至無(wú)色，再用80%乙醇洗至無(wú)色，分別收集各段洗脫液，測(cè)定金絲桃素濃度，并計(jì)算各部分金絲桃素的量。按下式分別計(jì)算比上柱量、比吸附量、比洗脫量。比上柱量=(上柱樣品液中金絲桃素的量-過(guò)柱液中殘余金絲桃素的量)/樹脂質(zhì)量;比吸附量=(上柱樣品液中金絲桃素的量-過(guò)柱液中殘余金絲桃素的量-水洗脫液中金絲桃素的量)/樹脂質(zhì)量;比洗脫量=80%乙醇洗脫部分金絲桃素的量/樹脂質(zhì)量，結(jié)果如圖1。

圖1 5種大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能實(shí)驗(yàn)Fig.1 Dynamic absorption experiments of 5 kinds of macroporous resins

從圖1可以看出，LSA－10在動(dòng)態(tài)篩選大孔吸附樹脂實(shí)驗(yàn)的各指標(biāo)均為最優(yōu)，結(jié)合靜態(tài)試驗(yàn)，LSA－10大孔吸附樹脂靜態(tài)洗脫率98.9%，靜態(tài)飽和吸附量1.924 0 mg/g，動(dòng)態(tài)比柱量為1.954 2、比吸附量1.927 0、比洗脫量1.768 2，亦優(yōu)于其它類型樹脂，因此選用LSA－10大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物。

2.3 LSA－10型大孔吸附樹脂的工藝參數(shù)考察

2.3.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇動(dòng)態(tài)洗脫效果的考察稱取處理好的LSA－10型大孔吸附樹脂10 g，精密稱定。取上柱溶液40 mL，控制體積流量1 mL/min上柱，預(yù)吸附2 h，過(guò)柱液重吸附一次，靜置12 h。收集過(guò)柱液，分別以5 BV的蒸餾水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，每瓶收集1 BV的洗脫液，共收集30份，其中1～5為蒸餾水洗脫液，6～10為20%乙醇洗脫液，11～16為50%乙醇洗脫液，17～22為70%乙醇洗脫液，23～30為95%乙醇洗脫液。將收集到的各洗脫液85℃水浴蒸干，測(cè)定金絲桃素。以金絲桃素量(Y)為縱坐標(biāo)，收集量瓶的編號(hào)(X)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 LSA－10型大孔樹脂吸附金絲桃素梯度洗脫曲線Fig.2 Gradient elution curve of adsorption hypericin by LSA－10

圖2結(jié)果表明，50%、70%、95%乙醇洗脫液為金絲桃素的主要存在部位，占金絲桃素總量的97.67%。而其中50%和70%乙醇洗脫液中金絲桃素量占總量的85.04%，95%乙醇洗脫液中金絲桃素量較少。70%乙醇的極性小于50%乙醇，相對(duì)而言可洗脫下的水溶性雜質(zhì)較少，可基本涵蓋50%乙醇洗脫液可以洗脫的金絲桃素量，且綜合考慮減少操作工序，節(jié)約生產(chǎn)成本等因素，初步確定洗脫條件為先用蒸餾水、20%乙醇洗去水溶性雜質(zhì)，再以70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分。2.3.2洗脫劑用量的考察精密吸取上柱溶液35 mL上柱，依次用蒸餾水、20%乙醇、70%乙醇洗脫，每瓶收集1 BV的洗脫液，依次按1，2，3，…編號(hào)，分別濃縮至干，測(cè)定每份洗脫液中金絲桃素量。以金絲桃素量(Y)為縱坐標(biāo)，收集量瓶編號(hào)(X)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，如圖3。

圖3 70%洗脫劑用量對(duì)金絲桃素洗脫終點(diǎn)的判斷Fig.3 Judgment of elution endpoint of by 70%eluant volume

從圖3可知，當(dāng)蒸餾水用量至4 BV、20%乙醇洗脫3 BV時(shí)，洗脫曲線已近橫軸且所收集的洗脫液幾乎無(wú)色，說(shuō)明水溶性雜質(zhì)已除去。采用70%乙醇洗脫，洗脫至8 BV時(shí)曲線已接近橫軸，且前8 BV洗脫液中金絲桃素量約占70%乙醇總洗脫量的96%以上，故確定洗脫液溶媒為8 BV 70%乙醇。

2.3.3 影響LSA－10型大孔樹脂吸附性能因素的正交試驗(yàn)考察根據(jù)文獻(xiàn)［12］，大孔吸附樹脂的吸附性能與藥液濃縮比、柱徑高比、上樣體積流量等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)篩選最佳上柱工藝條件。正交設(shè)計(jì)的因素水平表見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)因素水平Tab.2 L9(34)orthogonal design factors and levels

本正交試驗(yàn)以70%乙醇洗脫液中金絲桃素量(以100 g貫葉連翹藥材計(jì))為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

從表3、表4可知，影響因素大小的順序?yàn)锽＞A＞C，且方差分析結(jié)果表明，A和B因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著意義(P＜0.05)，最終確定最佳搭配為A2B1C2，即最佳方案為:藥液濃縮比為1∶1;層析柱半徑與柱高比為1∶20;藥液上樣體積流量為2 BV/h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)以最佳工藝條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，經(jīng)LSA－10型大孔吸附樹脂純化后，6批樣品中金絲桃素量均高于1.5%以上，且轉(zhuǎn)移率達(dá)70%以上。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于貫葉連翹提取物＞0.3%的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，證明此工藝合理可行。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of orthogonal tests

表4 方差分析(顯著性檢驗(yàn))Tab.4 Variance analysis chart(significance test)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)綜合考慮靜態(tài)吸附解吸與動(dòng)態(tài)吸附兩方面對(duì)大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物的影響，在靜態(tài)篩選大孔吸附樹脂實(shí)驗(yàn)中，HPD－600大孔吸附樹脂的靜態(tài)飽和吸附量較高為1.353 8 mg/g，靜態(tài)解析率卻較低，說(shuō)明HPD－600對(duì)金絲桃素的保留能力過(guò)強(qiáng)，較難洗脫;而D101、CAD－45的靜態(tài)解析率較高，靜態(tài)飽和吸附量卻較低，說(shuō)明此兩類樹脂極性較大，保留金絲桃素的能力較弱，均不適于純化貫葉連翹提取物。而SLA－10大孔吸附樹脂既對(duì)金絲桃素具有較大吸附量，又且易吸附、易解吸，其靜態(tài)飽和吸附量為1.924 0 mg/g，靜態(tài)洗脫率為98.9%，動(dòng)態(tài)比柱量為1.954 2、比吸附量為1.927 0、比洗脫量為1.768 2，可較高效的純化金絲桃素。在LSA－10型大孔吸附樹脂純化前，貫葉連翹提取物中金絲桃素量為0.38%，經(jīng)其純化后，金絲桃素量高于1.5%，表明LSA－10適合于貫葉連翹金絲桃素的純化，且其最佳工藝條件為L(zhǎng)SA－10型大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物，以層析柱半徑與柱高比為1∶20;藥液濃縮比為1∶1，藥液上樣體積流量為2 BV/h，4 BV蒸餾水、3 BV 20%乙醇為除雜洗脫溶劑，收集8 BV的70%乙醇洗脫液，減壓回收，真空干燥，即得純化的貫葉連翹提取物。

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