丹酚酸B對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

唐桂毅，李靖菲，李琳，徐成*，邵力鈞，周曉棉

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016;2.呼倫貝爾市人民醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021008)

缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，IRI)是指缺血組織或器官重獲血流灌注或氧供應(yīng)后，對(duì)組織或者器官所產(chǎn)生的損傷作用。腎臟為高灌注器官，對(duì)缺血及缺血后再灌注均較敏感［1］，因此腎缺血-再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)在臨床上較為常見(jiàn)，其病理生理變化多見(jiàn)于急性失血、中毒性休克、腎血管手術(shù)和腎臟移植等過(guò)程中。

丹酚酸(salvianolic acid)系丹參的水溶性有效成分，屬酚酸類化合物，在丹參的功效作用中占有重要地位。丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為丹參素。丹酚酸B由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，是目前研究較多的丹酚酸之一［2］。丹酚酸B具有廣泛的藥理作用，已有研究表明丹酚酸B對(duì)腦損傷、心肌缺血再灌注以及肝纖維化等方面有較好的保護(hù)作用［3］，但對(duì)RIRI的保護(hù)作用少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了丹酚酸B對(duì)RIRI大鼠的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑丹酚酸B(純度為95%，沈陽(yáng)藥科大學(xué)天然藥化教研室提供);水合氯醛(天津瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)20071016);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-6，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、尿蛋白(Proteinuria，PU)定量測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20080407)，血清肌肝(Creatinine，Cre)、尿素氮(Urea nitrogen，BUN)試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號(hào)20071029)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar雄性大鼠，50只，體質(zhì)量(250±20)g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(遼)2003-008。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器721型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Hu Air)，Model450自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio-Rod)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將50只雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，每組10只:缺血再灌注組(模型組)、假手術(shù)組(對(duì)照組)及丹酚酸B治療組(丹酚酸B 2.5、5.0、10.0 mg/kg組)。丹酚酸B各治療組分別于術(shù)前24 h和術(shù)后24 h、48 h腹腔注射同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丹酚酸B各1次，給藥容積為10 mL/kg(模型組和假手術(shù)組給予同容積的0.9%氯化鈉注射液)。

2.2 動(dòng)物模型制作大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹部備皮，碘伏消毒后，腹部正中切口暴露雙側(cè)腎臟，鈍性分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，保護(hù)輸尿管，距腎門0.5 cm處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈，夾閉50 min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)灌注，腎臟由暗紅色恢復(fù)紅潤(rùn)表明再灌注成功;如果松開動(dòng)脈夾5 min未恢復(fù)紅潤(rùn)，則視為再灌注失敗，棄去不用。然后逐層縫合切口。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)腎蒂(不結(jié)扎)，暴露50 min后再關(guān)閉切口，不做腎缺血處理。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)采集的大鼠血液3 000 r/min離心15 min后取血清分裝后－80℃冰箱保存，按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法分別測(cè)定Cre、BUN、MDA、SOD、IL-6、IL-8和TNF-α的水平。術(shù)后48～72 h內(nèi)收集大鼠尿液，用來(lái)檢測(cè)尿中含尿蛋白量。術(shù)后72 h處死大鼠，取兩側(cè)腎臟置于10%中性甲醛固定以制備石蠟切片，于光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白的變化情況模型組與假手術(shù)組比較，前者大鼠血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白水平明顯升高;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性的降低RIRI后血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白水平，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)尤為明顯。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)RIRI大鼠BUN、Cre和PU的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of salvinolic acid B on contents of BUN，Cre and PU in RIRI rats(±s，n=10)

表1 對(duì)RIRI大鼠BUN、Cre和PU的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of salvinolic acid B on contents of BUN，Cre and PU in RIRI rats(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)BUN/(mmol·L－1)Cre/(μmol·L－1)PU/(mg·L－1)28.11±3.96174.69±12.99167.01±8.61假手術(shù)組－7.11±2.02＊＊88.87±9.06＊＊6.26±4.23＊＊丹酚酸B組2.524.58±1.92157.54±10.24156.61±9.18丹酚酸B組5.021.22±3.50130.18±9.80*117.05±7.62*丹酚酸B組10.017.10±2.31*111.86±11.04＊＊86.81±8.93模型組－＊＊

3.2 對(duì)腎組織病理學(xué)的改變腎組織以10%中性甲醛溶液固定，在脫水、透明、浸蠟、包埋后，切成石蠟切片，經(jīng)HE染色，400倍光鏡下觀察腎組織損傷情況。光鏡下，假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常;丹酚酸B 10 mg/kg組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，腎間質(zhì)未見(jiàn)異常;模型組腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)腎小管腔內(nèi)有少量蛋白質(zhì)液積聚，腎小球出現(xiàn)水腫、萎縮。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 腎組織在光鏡下形態(tài)Fig.1 Morphous of kidney under light microscope

3.3 血清中SOD、MDA的變化情況與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MDA水平明顯升高，SOD活性明顯下降;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性降低RIRI后血清中MDA水平，升高SOD活性，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)作用最顯著。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)RIRI大鼠血清中SOD和MDA的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of salvianolic acid B on contents of SOD and MDA in serum in RIRI rats(±s，n=10)

表2 對(duì)RIRI大鼠血清中SOD和MDA的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of salvianolic acid B on contents of SOD and MDA in serum in RIRI rats(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)SOD/(U·mL－1)MDA/(nmol·mL－1)86.03±6.6313.76±1.39假手術(shù)組－159.72±5.02＊＊6.43±1.09＊＊丹酚酸B組2.599.34±7.1412.19±1.45丹酚酸B組5.0116.52±6.56*10.08±1.02*丹酚酸B組10.0135.95±5.21＊＊8.15±1.27模型組－＊＊

3.4 血清中IL-6、IL-8、TNF-α的變化情況模型組與假手術(shù)組比較，前者大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性降低RIRI后血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)作用更明顯。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)RIRI大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響±s，n=10)Tab.3 Effects of salvianolic acid B on contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in serum in RIRI rats±s，n=10)

表3 對(duì)RIRI大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響±s，n=10)Tab.3 Effects of salvianolic acid B on contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in serum in RIRI rats±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)IL-6/(pg·mL－1)IL-8/(pg·mL－1)TNF-α/(pg·mL－1)54.64±5.9227.58±2.6085.16±3.63假手術(shù)組－15.02±3.66＊＊17.91±1.54＊＊54.12±2.18＊＊丹酚酸B組2.549.96±5.1025.35±2.1881.51±3.77丹酚酸B組5.037.30±5.61*23.31±2.4870.38±2.59*丹酚酸B組10.026.05±4.64＊＊20.37±1.92*61.42±3.67模型組－＊＊

4 討論

腎缺血再灌注能夠造成腎單位的廣泛性破壞，包括腎小球?yàn)V過(guò)率下降，但其通透性增強(qiáng);腎小管上皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致腎小管的重吸收作用減弱等。常見(jiàn)臨床表現(xiàn)為血清中BUN和Cre升高，同時(shí)出現(xiàn)蛋白尿［4-5］等癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹酚酸B能顯著降低血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白的含量，減輕缺血再灌注對(duì)腎小球和腎小管的損傷。因此，丹酚酸B對(duì)RIRI大鼠有較好的保護(hù)作用。

雖然RIRI的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。但近年來(lái)的研究表明大量氧自由基的產(chǎn)生以及免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在RIRI的發(fā)病中起關(guān)鍵作用［6-7］，并且存在一定的聯(lián)系。

RIRI時(shí)，大量的氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)可通過(guò)黃嘌呤氧化酶、線粒體和花生四烯酸等多種途徑，由組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生。近年大量研究證實(shí)，自由基反應(yīng)是導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷的重要原因［8］，其損傷機(jī)制為:①OFR可直接與生物膜上的不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，其產(chǎn)物MDA對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用;②OFR可破壞蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞間基質(zhì)，從而加劇細(xì)胞損傷;③腎臟缺血時(shí)，增加的OFR可誘發(fā)組織細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腎臟損傷;④RIRI時(shí)，可促進(jìn)某些促炎基因產(chǎn)物的表達(dá)和生物活性分子的產(chǎn)生，促進(jìn)白細(xì)胞激活和趨化聚集，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腎損傷。SOD是超氧陰離子的專一性活化酶，其活性的高低反映了機(jī)體抗自由基水平的強(qiáng)弱［9］。由于氧自由基半衰期太短很難直接測(cè)定，所以常選擇測(cè)定SOD的活力;而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，它的含量反映了自由基攻擊機(jī)體細(xì)胞的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹酚酸B能夠升高RIRI大鼠血清SOD的活性，降低MDA的水平。因此，丹酚酸B對(duì)RIRI的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成、提高機(jī)體SOD的活性并提高清除自由基能力，從而打破氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

文獻(xiàn)證明許多炎癥因子參與了RIRI的病理生理過(guò)程［10］，其中TNF-α、IL-6和IL-8是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。而TNF-α具有廣泛的生物學(xué)作用，被認(rèn)為是重要的促炎因子［11］。在RIRI期間，TNF-α參與RIRI的可能機(jī)制［12］是:①TNF-α誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌和釋放IL-6、IL-8、OFR和TNF-α本身等炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使炎癥反應(yīng)放大［13-14］;②炎癥時(shí)，炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生iNOS，并合成大量NO，高濃度的NO具有潛在的有害作用，一方面引起持續(xù)的血管擴(kuò)張，使血壓下降，導(dǎo)致腎臟進(jìn)一步缺血，炎癥損傷加重;另一方面，NO可產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)，如過(guò)氧亞硝酸鹽及其不穩(wěn)定過(guò)程中分解的羥自由基，進(jìn)而引起腎臟損傷;③TNF-α可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增加中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏連，有助于白細(xì)胞炎癥滲出及其它炎癥細(xì)胞遷移至炎癥區(qū);同時(shí)這種黏連能堵塞微循環(huán)，最終導(dǎo)致再灌注后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象［15］;④IL-8激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的呼吸爆發(fā)，引起酶的外釋和OFR的增加，加強(qiáng)致炎反應(yīng)，對(duì)腎臟造成損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹酚酸B組能夠降低RIRI后血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平，從而減輕腎I/R損傷程度。因此，丹酚酸B抗大鼠RIRI的機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Bonventre等［16］以及Chien等［17］證明在RIRI中，OFR的產(chǎn)生與早期凋亡及炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，說(shuō)明OFR參與了炎癥反應(yīng)。發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，炎癥細(xì)胞可以釋放大量細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-8等，使白細(xì)胞呼吸爆發(fā)，又產(chǎn)生大量的OFR，結(jié)果造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致一種惡性循環(huán)。因此，丹酚酸B的作用機(jī)制可能是:①通過(guò)減少腎缺血再灌注損傷后自由基的產(chǎn)生，從而間接的減輕腎缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng);②直接降低OFR對(duì)中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)核蛋白因子(nuclear factor kappa，NF-κB)的活化作用，來(lái)減少炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，緩解了炎癥反應(yīng)。

綜上所述，丹酚酸B對(duì)RIRI大鼠具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)減輕RIRI后氧自由基的損傷以及緩解炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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