短時(shí)重復(fù)游泳調(diào)節(jié)SAM8鼠AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

呂媛媛 趙 麗 王德剛 (北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

短時(shí)重復(fù)游泳調(diào)節(jié)SAM8鼠AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

呂媛媛 趙 麗 王德剛 (北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

目的 觀察短時(shí)重復(fù)游泳訓(xùn)練對(duì)SAM鼠AMPA受體GluR1亞單位磷酸化的影響，探討運(yùn)動(dòng)改善腦功能的可能機(jī)制。方法 選取3月齡SAMP8(prone/8)亞系為研究對(duì)象，運(yùn)動(dòng)模型采用2 w游泳方案：2次/d，每次6 min的游泳，結(jié)束后給予浴巾擦干放回鼠籠;對(duì)照組則在相同時(shí)間每天給予兩次相同的浴巾安撫刺激。采用Western印跡方法，檢測(cè)SAM8鼠海馬和皮層AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser 845位點(diǎn)的磷酸化水平的變化。結(jié)果 SAMP8海馬、皮層中AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平與對(duì)照組相比均增加(P＜0.05)。結(jié)論 2 w的短時(shí)間重復(fù)游泳運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激誘導(dǎo)劑促進(jìn)了AMPA受體的活化，這可能是運(yùn)動(dòng)改善腦功能的機(jī)制之一。

游泳;GluR1;磷酸化作用;SAM8鼠

快速老化小鼠(SAM)8和SAM10可作為自然發(fā)病的老化癡呆鼠模型，它們除具有阿爾茨海默病(AD)明顯學(xué)習(xí)記憶障礙的特點(diǎn)和諸多神經(jīng)病理特征外，尚可出現(xiàn)一些神經(jīng)遞質(zhì)和自由基代謝方面的病理改變。在腦內(nèi)眾多參與學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)中，谷氨酸是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體有促離子型和促代謝型兩大類，其中促離子型α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體在信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育和突觸可塑性(包括學(xué)習(xí)記憶)等方面都起著非常重要的作用。AD的病因和病理機(jī)制復(fù)雜，缺乏體力運(yùn)動(dòng)或受教育程度低等社會(huì)因素都明顯增加AD的發(fā)生率〔1，2〕，而對(duì)AD早期病人無(wú)論是社會(huì)、運(yùn)動(dòng)或心理因素的干預(yù)都可以減輕癡呆程度、利于記憶恢復(fù)〔3，4〕，但其保護(hù)機(jī)制目前并不清楚。本研究觀察短時(shí)重復(fù)游泳訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式對(duì)SAM8小鼠腦內(nèi)AMPA受體活化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，健康雄性、清潔級(jí)3月齡SAMP8小鼠16只，體重25～30 g。GluR1的S831和S845抗體購(gòu)于Abcam公司;β-actin抗體及IgGA二抗購(gòu)自Proteintech公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker購(gòu)自biolab公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;PMSF(苯甲基磺酰氟化物)、DTT、考馬斯亮藍(lán) G-250、BSA、Tris(三羥甲基氨基甲烷)購(gòu)自Amresco公司;Stripping Buffer購(gòu)自北京華肽先鋒生物科技有限公司;磷酸酶抑制劑購(gòu)自Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用的移液器(Eppendorf，德國(guó))，組織勻漿器(Staufen，德國(guó))，721型可見光分光光度計(jì)(上海菁華)，紫外可見光分光光度計(jì)(島津，日本)，低溫高速離心機(jī)(Beckman，美國(guó))，電泳儀(北京六一儀器廠)，自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，數(shù)字式酸度計(jì)(E-201-C9型)(上海理達(dá)儀器廠)均由北京體育大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 運(yùn)動(dòng)模型 選取16只3月齡SAMP8(prone/8)亞系作為研究對(duì)象，由于此種系小鼠攻擊性很強(qiáng)，為了避免打架造成的傷亡，分籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，室溫(25±2)℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)及游泳運(yùn)動(dòng)3 d后正式入組，盡可能同窩鼠隨機(jī)分入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只，游泳組方案參照Shaomin Li的2 w游泳方案〔5〕。游泳組進(jìn)行每天兩次，每次6 min的游泳，結(jié)束后給予浴巾擦干放回鼠籠;對(duì)照組則在相同時(shí)間每天給予兩次相同的浴巾安撫刺激。最后一次游泳訓(xùn)練結(jié)束后48 h內(nèi)麻醉小鼠分別取皮層和海馬組織。

1.3.2 測(cè)試方法 取小鼠的海馬和皮層各100 mg，加入1 ml胞漿裂解液，于冰水浴中電動(dòng)勻漿，靜置30 min后，離心30 min，取上清液分裝，存于-80℃冰箱待測(cè)。采用Bradford法測(cè)定總蛋白含量，計(jì)算好上樣量后，調(diào)整蛋白濃度，于100℃加熱5 min，使蛋白充分變性。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%BSA室溫封閉60 min后，加入一抗(GluR1的S831和S845 位點(diǎn)抗體1∶500，β-actin抗體1∶1 000)，室溫下孵育60 min后，4℃過(guò)夜。次日將PVDF膜用PBST洗3×10 min后，加入二抗(三種蛋白二抗?jié)舛染鶠?∶4 000)孵育60 min，用PBST洗3×10 min后，于暗室用ECL發(fā)光液顯影，曝光。膠片經(jīng)生物電泳圖像分析系統(tǒng)掃描后，分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 短時(shí)重復(fù)游泳訓(xùn)練對(duì)SAM8小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser845位點(diǎn)磷酸化的影響

SAM8+運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser845位點(diǎn)的磷酸化較對(duì)照組相比均增加(3.46±0.47，1.42±0.13，P ＜0.05)，其中海馬中 GluR1-Ser845 磷酸化水平明顯增加是對(duì)照組的3.46倍(P＜0.01)。

2.2 短時(shí)重復(fù)游泳訓(xùn)練對(duì)SAM8小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser831位點(diǎn)磷酸化的影響

SAM8+運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬、皮層中GluR1-Ser831位點(diǎn)的磷酸化較對(duì)照組相比均增加(1.24±0.11，2.12±0.36，P＜0.05)，其中皮層中 Ser831磷酸化水平明顯增加是對(duì)照組的2.12倍(P＜0.01)。

3 討論

運(yùn)動(dòng)作為一種特殊的干預(yù)手段，其在慢性心血管疾病、2型糖尿病、癌癥、癡呆等與年齡相關(guān)聯(lián)的一些疾病中的積極作用已多有報(bào)道〔6～8〕。但來(lái)自于不同實(shí)驗(yàn)室的研究證明不同運(yùn)動(dòng)模式及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)不同群體的作用也不盡一樣。對(duì)嚙齒類動(dòng)物來(lái)講游泳運(yùn)動(dòng)是一種緊張性應(yīng)激刺激，依據(jù)刺激強(qiáng)度不同游泳運(yùn)動(dòng)可使小鼠海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)增強(qiáng)或降低，LTP被認(rèn)為是在細(xì)胞水平參與學(xué)習(xí)和記憶的形成。比如10 min的游泳會(huì)削弱LTP的形成，15 min的游泳則起到了抑制LTP的作用，而2 min的游泳能使早期的 LTP轉(zhuǎn)變成晚期 LTP〔9，10〕。Li等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激程度不同即運(yùn)動(dòng)模式不同，對(duì)海馬學(xué)習(xí)和突觸可塑性產(chǎn)生或促進(jìn)或抑制LTP形成的作用，其應(yīng)答的復(fù)雜性與富集環(huán)境刺激的實(shí)驗(yàn)相似，如持續(xù)的新穎暴露會(huì)損傷LTP的建立，而短時(shí)新穎探索則促進(jìn)海馬LTP誘導(dǎo)。

LTP維持的形成機(jī)制與興奮性突觸后電位的AMPA成分持續(xù)性增強(qiáng)有關(guān)。突觸后AMPA電流增強(qiáng)的原因之一是突觸后膜上AMPA受體功能活動(dòng)的增強(qiáng)，突觸后膜上AMPA受體因發(fā)生磷酸化而功能活動(dòng)增強(qiáng)，出現(xiàn)電導(dǎo)加大或開放概率增加。AMPA受體是GluR1～GluR4 4個(gè)亞單位組成的多聚體，在所有AMPA受體亞單位中，GluR1對(duì)于成熟動(dòng)物海馬LTP的建立非常重要。研究報(bào)道AD病人海馬區(qū)域GluR1水平下降了43%〔12〕，提示突觸后膜AMPA受體功能的改變與AD認(rèn)知障礙的發(fā)生有關(guān)。在AMPA受體中主要起作用的是GluR1C末端的絲氨酸磷酸化，GluR1有兩個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)，Ser831和Ser845，它們的磷酸化作用可改變AMPA受體的功能，對(duì)于各種形式的突觸可塑性以及空間記憶的維持有重要的作用。與我們的研究結(jié)果相類似的有Levine等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)大鼠跑輪運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)海馬齒狀回腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、AMPA受體的表達(dá)升高，同時(shí)能夠降低LTP閾值、促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所采用的游泳方案對(duì)SAM8鼠是一種良性應(yīng)激刺激，可誘導(dǎo)參與學(xué)習(xí)記憶的海馬和皮層中AMPA受體通道的磷酸化程度增加，使得突觸活動(dòng)功能增強(qiáng)，這可能是運(yùn)動(dòng)改善AD患者腦功能的機(jī)制之一。同時(shí)說(shuō)明在改善腦功能時(shí)運(yùn)動(dòng)作為一個(gè)干預(yù)手段，其運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度要求并不大，達(dá)到陽(yáng)性刺激即可，與我們之前提出的運(yùn)動(dòng)毒理學(xué)效應(yīng)〔14〕相一致。

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A transient，but repeated swimming regulating the GluR1 phosphorylation of AMPA receptor in SAM8 mice

Lü Yuan-Yuan，ZHAO Li，WANG De-Gang.
College of Science of Sport and Human Body，Beijing Institute of Physical Education，Beijing 100084，China

Objective To investigate the effects of a transient，but repeated swimming on the GluR1 phosphorylation of AMPA receptor in SAM8 mice，and explore the possible molecular mechanisms for exercise improving brain function.Methods 16 male SAM8 mice were equally randomized into normal and swimming groups.Swimming protocol was conducted twice a day for 6 min，each for a total of 14 days.After swimming，the mice were dried with a towel and placed back into their original cage.A control group of animals was handled for 6 s，wrapped in a towel twice a day for 14 days to simulate the handle after swimming.The phosphorylation of GluR1 at Ser831 and Ser845 were measured by Western blot.Results Compared with normal group，both in cortex and in hippocampus，the phosphorylation degree of GluR1 at Ser831 and Ser845 were significantly increased(allP＜0.01).Conclusions 2-week swimming protocol may be a stress inducer which lead to the activation of AMPA receptor，and that may be the one of mechanisms of exercise benefiting brain function.

Swimming;GluR1;Phosphorylation;SAM8

Q419

A

1005-9202(2012)14-2962-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.14.027

國(guó)家自然科學(xué)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(31040044);高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目(B08045)

趙 麗(1970-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事運(yùn)動(dòng)與神經(jīng)可塑性研究。

呂媛媛(1984-)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事運(yùn)動(dòng)與神經(jīng)可塑性研究。

〔2011-11-18收稿 2011-12-20修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)