大鼠體外循環(huán)模型研究中的若干問題

朱 斌

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730

自20世紀(jì)50年代人類成功實施第1例體外循環(huán) (cardiopulmonary bypass，CPB)起，CPB一直是心臟外科手術(shù)的重要前提和保障［1］。CPB的材料、技術(shù)管理水平和人類對CPB的認(rèn)識在過去的50多年里已經(jīng)有了極大的進(jìn)步，術(shù)后患者的死亡率和發(fā)病率也有了很大程度的降低，但是重要臟器的損傷和功能障礙在術(shù)后仍然是一個令人憂心的臨床問題。以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為例，心臟手術(shù)CPB后，患者腦梗死發(fā)生率為3.5%，術(shù)后認(rèn)知功能障礙 (postoperative cognitive dysfunction，POCD)在術(shù)后1周高達(dá)50%～70%，在術(shù)后6周降低至30%～50%，在術(shù)后半年至1年仍高達(dá)20% ～40%［2-3］。因此，對于一些在心臟表面進(jìn)行的手術(shù)如心臟搭橋手術(shù)，研究者嘗試在非體外循環(huán)下進(jìn)行，以期望避免CPB相關(guān)的并發(fā)癥。Shroyer等［4］按照上述思路將2203例冠狀動脈旁路移植術(shù) (coronary artery bypass grafting，CABG)手術(shù)患者隨機(jī)分為CPB和非CPB組，結(jié)果顯示術(shù)后30 d內(nèi)，兩組患者在短期終點事件 (死亡、需二次手術(shù)、心跳驟停、昏迷、中風(fēng)及腎功能衰竭等并發(fā)癥)的整體發(fā)生率上無差異;在術(shù)后1年內(nèi)，CPB組患者的長期終點事件 (死亡、需再次進(jìn)行冠脈血運(yùn)重建、非致命心肌梗死)整體發(fā)生率顯著低于非CPB組患者;兩組患者在POCD結(jié)局方面無差異。由此可見，CPB未必就是心臟手術(shù)后患者死亡率和并發(fā)癥發(fā)生率的罪魁禍?zhǔn)?，而對于絕大多數(shù)心臟外科手術(shù)，特別是心腔內(nèi)手術(shù)，CPB卻依舊是重要的前提。因此，應(yīng)該加強(qiáng)對心臟手術(shù)和CPB的研究，而如何建立高度模擬臨床實際情況的動物模型則是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

建立大鼠體外循環(huán)模型技術(shù)難度大

建立模擬心臟手術(shù)CPB的動物模型需要考慮的問題主要集中在兩個方面:實驗動物的選擇和如何能確保該動物模型盡可能接近臨床。利用大動物(如實驗狗或豬)建立的CPB模型比較容易模擬臨床，基本能夠?qū)崿F(xiàn)正中開胸、直接的心臟操作、主動脈阻斷及直接灌注心臟停跳液停跳心臟等心臟手術(shù)不可或缺的步驟。但是這類動物模型成本昂貴，僅建立模型就需要一組人，術(shù)后實驗動物需要進(jìn)駐動物ICU且仍舊難以長時間存活，各種靶器官損傷的評價指標(biāo)有限且難以標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是目前尚缺乏一套公認(rèn)的認(rèn)知功能評價體系。因此，更多的實驗室嘗試?yán)眯游?，如大鼠進(jìn)行CPB相關(guān)研究。利用大鼠建立CPB模型的優(yōu)點在于:大鼠相對廉價、易存活、術(shù)后不需要ICU監(jiān)護(hù)、建立模型僅需1位操作者、各種靶器官損傷的評價指標(biāo)多且標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是大鼠認(rèn)知功能的評價體系相對完善。但是由于大鼠體積小，而且建立CPB需要盡可能用大內(nèi)徑套管進(jìn)行多支血管置管 (以確保足量的引流、灌注、血壓監(jiān)測和靜脈給藥途徑)，這就需要較高的血管置管技術(shù)［5-6］。因此，目前世界上僅有幾家實驗室成功建立了大鼠CPB模型。此外，為了確保實驗動物能夠存活，目前大多數(shù)實驗室建立的大鼠CPB模型均沒有實施正中開胸和直接心臟操作，也沒能實現(xiàn)利用心臟停跳液停跳心臟這一心臟手術(shù)的基本步驟。盡管如此，大鼠CPB模型研究的成功率也并不高。能檢索到國內(nèi)幾家實驗室曾經(jīng)發(fā)表過的建立大鼠CPB模型的文獻(xiàn)，多數(shù)沒有后續(xù)的研究發(fā)表。推測其原因是，這些實驗室嘗試過該模型，但未能繼續(xù)進(jìn)行該方面工作。南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心胸外科實驗室可能是目前國內(nèi)唯一成功建立起大鼠CPB的單位，支持的依據(jù)是他們在國內(nèi)外連續(xù)發(fā)表了基于該模型的一些研究工作。

基于上述原因，目前多傾向利用大鼠CPB模型來研究心臟手術(shù)CPB相關(guān)并發(fā)癥，特別是有關(guān)POCD的研究，但這些模型目前所面臨的共同問題是，在一些重要技術(shù)細(xì)節(jié)上沒有能夠模擬心臟手術(shù)體外循環(huán)的臨床實際情況。

大鼠CPB模型研究目前存在的主要問題

大鼠CPB模型研究目前存在的主要問題包括:(1)CPB流量在150 ml/(kg·min)以下，而大鼠的正常心輸出量在170～180 ml/(kg·min)之間;(2)建立動脈測壓和靜脈輸液管道時采用的是大鼠股動脈和股靜脈，這雖然降低了外科準(zhǔn)備的難度，但不利于大鼠術(shù)后恢復(fù)，甚至可能有礙于術(shù)后神經(jīng)學(xué)功能的評估;(3)未能實現(xiàn)利用心臟停跳液停跳心臟 (cardioplegic arrest，CA)。Günzinger等［7］曾嘗試直接阻斷主動脈并灌注停跳液，大鼠心臟成功被停跳。由于研究者是在正中開胸和雙側(cè)頸總動脈置管結(jié)扎前提下進(jìn)行的實驗，理論上講實驗大鼠術(shù)后沒有存活的可能。Drabek等［8］在大鼠深低溫停循環(huán)(deep hypothermia circulatory arrest，DHCA)模型上，試圖通過外周靜脈灌注心臟停跳液，其結(jié)果是，受試心臟的確也能停止跳動，但是不足5min后，心臟又自動復(fù)跳。(4)在CPB模型基礎(chǔ)上建立DHCA時，沒有能夠真正實現(xiàn)停循環(huán)。盡管有研究者曾經(jīng)報道，在建立大鼠CPB后，降溫至直腸溫度為15～18℃時，心臟可以自行停止跳動，因此此時如果停止CPB泵，便可實現(xiàn)停循環(huán)［9］。但事實上當(dāng)大鼠體溫降低至15～18℃時，心臟依舊有一定的心電和機(jī)械活動，此時如果通過停CPB泵來獲得停循環(huán)，心臟基本都是因缺血而停跳，這一點在Drabek等［8］研究中已經(jīng)得到證實。他們將大鼠體溫通過CPB降低至15℃時，停CPB泵后，仍然可以觀察到35次/min左右的心率和43 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右的平均動脈壓。(5)盡管目前心臟手術(shù)CPB后POCD的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，但是多數(shù)證據(jù)還是提示，炎癥反應(yīng)、大腦微栓塞和低灌注/缺血再灌注損傷可能是最主要的原因［10］。遺憾的是，目前還沒有任何一個大鼠CPB模型能同時模擬這3種損傷機(jī)制。(6)還有的實驗室在建立CPB和DHCA模型時，不僅使用了大鼠雙側(cè)的股動脈，甚至不進(jìn)行氣管插管，而試圖在CPB過程中保留受試動物的自主呼吸［11］。雙側(cè)股動脈被置管并在術(shù)后被結(jié)扎，這增加了受試大鼠術(shù)后的康復(fù)難度;而在整個CPB過程中不進(jìn)行氣管插管和機(jī)械通氣則基本是超出了臨床的想象。

理想的大鼠CPB模型

美國杜克大學(xué)麻醉科體外循環(huán)研究室所建立的大鼠CPB模型，可能是目前世界上能最大程度模擬心臟手術(shù)CPB臨床實際情況的大鼠CPB模型。研究者成功地建立了全球第1個可以利用心臟停跳液CA且實驗大鼠可以長期存活的全流量、不輸血大鼠CPB模型［12-13］。采用多普勒超聲準(zhǔn)確定位4.5F多孔套管于右心房，這確保了充分的靜脈引流，使CPB流量達(dá)到170～180 ml/(kg·min)。利用腹壁尾側(cè)淺動脈和淺靜脈建立動脈測壓和靜脈輸液管道，保留了大鼠的股動脈和股靜脈，這增加了手術(shù)難度，但是利于大鼠術(shù)后恢復(fù)。利用超聲引導(dǎo)經(jīng)右側(cè)頸總動脈在升主動脈內(nèi)置入雙腔球囊擴(kuò)張導(dǎo)管至主動脈根部，用于灌注心臟停跳液以實現(xiàn)心臟停跳。

盡管杜克大鼠CPB模型是目前可以見到的能在最大程度上模擬心臟手術(shù)臨床實際情況的大鼠CPB模型，但同樣也存在一些令人尷尬的困惑。2006年，該實驗室利用健康成年大鼠建立了CPB流量為100～110 ml/(kg·min)的CPB模型，研究者測定了炎癥因子水平，并在術(shù)后4～7周和12周對存活大鼠進(jìn)行了認(rèn)知功能測試 (Can測試和水迷宮實驗)，發(fā)現(xiàn)60 min的常溫CPB受試大鼠與非CPB大鼠相比，并沒有產(chǎn)生更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能障礙［14］。幾年后再次采用該 CPB模型來進(jìn)行POCD研究，依舊是利用健康成年大鼠，采用幾乎相同的外科血管穿刺置管技術(shù)建立了CPB流量為150～170 ml/(kg·min)的CPB模型，在術(shù)后第3、7、14天和第6周對存活大鼠進(jìn)行了認(rèn)知功能測試 (標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)學(xué)評分和水迷宮實驗)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)75 min的常溫CPB受試大鼠與非CPB大鼠相比，產(chǎn)生了明顯的認(rèn)知功能障礙［15］。研究者推測其原因可能是實驗?zāi)Ｐ偷募?xì)微差別 (CPB流量和時間)導(dǎo)致了這種明顯的矛盾結(jié)論。這些看似矛盾的研究結(jié)果在某種程度上也提醒科研人員，動物實驗研究盡管較臨床研究可控性強(qiáng)，但是實驗動物模型的可重復(fù)性仍然有待提高。

總之，理想的實驗動物模型并非完美，對于科學(xué)研究而言，在確保大鼠CPB模型如何更加真實地模擬心臟手術(shù)體外循環(huán)的臨床實際情況外，還必須強(qiáng)調(diào)如何提高模型的可重復(fù)性。

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