環(huán)孢素A及他克莫司對移植腎受者Th免疫基因的調控

文 進，紀志剛，牛吉瑞

中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 北京協和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

·論著·

環(huán)孢素A及他克莫司對移植腎受者Th免疫基因的調控

文 進，紀志剛，牛吉瑞

中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 北京協和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

目的觀察環(huán)孢素A (CsA)和他克莫司(FK506)分別作用后，移植腎受者Th基因的表達變化。方法分離移植腎受者在藥物作用前后24 h的外周血淋巴細胞，將其總RNA分別逆轉錄并行實時定量PCR檢測，使用生物信息學方法對檢測結果進行比較分析。結果CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調，IL-2、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IL15、IRF4、TFCP2基因顯著下調。FK506作用24h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調，CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調。結論CsA 及FK506可能通過調控以上輔助性T淋巴細胞免疫基因發(fā)揮藥理作用。

基因表達調控；腎移植；基因芯片；環(huán)孢素A；他克莫司

ActaAcadMedSin，2012,34(6)：563-566

環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)和他克莫司(tacrolimus, FK506)是同種異體腎移植術后主要的免疫抑制治療藥物，同屬鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurine inhibitor，CNI)類藥物，但其在免疫調節(jié)效應、用藥劑量和不良反應等方面卻各具特點。本研究采用功能分類基因芯片，觀察了CsA和FK506對移植腎受者輔助性T淋巴細胞(Th)免疫基因的影響，以期從中篩選出差異表達基因進行功能研究，從而揭示二者作用靶基因，為臨床有效用藥提供新的理論和實驗依據。

材料和方法

標本來源隨機選取2011至2012年在北京協和醫(yī)院接受同種異體腎移植術的志愿者4名(手術當日及術后48 h內外周血白細胞數正常，淋巴細胞計數日變化量不超過CBC-3DL血液自動分析儀允許誤差范圍，4×108/L)，每人在CsA和FK506治療前及治療后24 h各提供10 ml全血，經分離、純化可得107個淋巴細胞。

主要儀器和試劑淋巴細胞分離液購于上海試劑二廠，RNA抽提試劑Trizol購自美國GIBCO公司，免疫基因芯片“Human Th1-Th2-Th3”為上?？党缮镉邢薰井a品。

實驗分組根據使用的CNI不同, 分為CsA組和FK506組，即CsA和FK506作用24 h時，外周血淋巴細胞作實驗組，藥物治療前外周血淋巴細胞作對照組。CsA用量為6 mg/(kg·d)，FK506用量為0.1 mg/(kg·d)。

淋巴細胞分離采集EDTA抗凝外周全血標本，在無菌條件下采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞；取外周血，肝素抗凝，全血2000 r/min離心10 min；吸白膜，加入適量1%甲基纖維素除血小板，少許羰基鐵粉祛除單核細胞，充分混勻。室溫旋轉培養(yǎng)25 min，立30 min。取上清緩慢轉入另一已加入5 ml淋巴細胞分離液的離心管中，并使上述混合液處于淋巴細胞分離液液面之上，保留清晰的界面，2000 r/min離心30 min；用移液槍小心分離出淋巴細胞層；用已除RNA酶的PBS清洗細胞。先后以2000 r/min 10 min，1200 r/min 6 min，800 r/min 6 min離心回收細胞，棄去上清。

總RNA抽提采用一步法抽提總RNA。每10 ml全血分離出的淋巴細胞加入2 ml的Trizol試劑，用一次性注射器進行反復抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，使之充分溶解于Trizol中形成清亮不黏稠的液體；加0.4ml氯仿分離RNA，1 ml異丙醇沉RNA，2 ml 75%乙醇洗滌，Rnase-free 的水溶解RNA，紫外分光光度計檢測A260/A280比值及濃度。RNA樣本的OD260/OD280應在1.7～2.2之間，總RNA電泳圖譜有清晰的28 S 、18 S條帶且28S=2×18S為合格樣品。 -70℃凍存。

實時定量PCR聚合酶激活/變性，95℃，10 min；擴增40個循環(huán)，95℃，15 s；60℃，1 min，收集熒光。陽性結果判斷：挑選差異表達的探針函數返回一個PC類的對象，包括兩部分fc和tt，fc是log2 fold change，而tt是t檢驗的P值。Log2(FC)>2或<-2為差異表達基因。

結 果

CsA作用組差異表達基因CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調，IL-2、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IL15、IRF4、TFCP2基因顯著下調。

FK506作用組差異表達基因FK506作用24 h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調, IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、 CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調。

討 論

機體對移植腎的免疫應答主要包括以下幾個過程：(1)抗原遞呈細胞對移植腎人類白細胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)的識別和提取。(2)共刺激信號誘導淋巴細胞的活化，包括：早期跨膜信息的傳遞；各種早反應基因的轉錄性活化；新的淋巴細胞表面分子的表達；T、B淋巴細胞增殖的誘導，分化出各種效應細胞通過各種途徑攻擊移植腎，引起各種類型排斥反應[1]。研究表明, CD4+Th1細胞主要參與急性排斥反應，CD4+Th2細胞則主要參與慢性排斥反應，而CD8+T細胞在移植排斥反應中除具有攻擊殺傷的細胞毒作用外，同時還具有免疫調節(jié)效應。迄今為止，抑制移植排斥反應的最好辦法仍是應用免疫抑制劑。腎臟移植外科手術以后，免疫抑制應用及調控至關重要，不同的免疫抑制劑應用方案及免疫調控手段，可能使腎臟移植受者出現不同的結局。目前采用以CsA和Fk506為基礎的免疫抑制治療方案[2-3]。

蛋白水平研究表明，CsA是一種CNI，通過與T細胞胞漿內的CsA受體結合，抑制T細胞的活化與增殖，產生免疫抑制。CsA的臨床應用使器官移植存活率上升到80%～90%。FK506也是一種CNI，主要作用于T細胞，但免疫抑制作用為CsA的10～100倍。FK506進入細胞內首先與FK506結合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)結合成復合體，該復合體抑制神經鈣調磷酸酶，阻止了T細胞核中的活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)[4-5]。 隨著分子免疫學研究的飛速發(fā)展，人們逐漸認識到機體針對移植腎的免疫應答嚴格受各種基因控制。免疫抑制藥物通過對各條免疫應答途徑涉及的一系列基因調控，實現其藥理作用。

本研究采用輔助性T淋巴細胞(Th)基因芯片分析CsA和FK506對移植腎受者Th免疫基因的影響，從中篩選出差異表達基因，進而了解這兩種常用的CNI免疫調節(jié)作用的異同,以求正確評估兩藥在抗排斥反應的差別，為患者預防排斥反應及為腎移植術后制訂更加合理的免疫抑制方案提供實驗依據。該芯片是一種功能分類基因芯片，所有入選基因幾乎都與某一明確的信號通路直接相關， 并且通常都可以找到論證其入選資格的科學文獻。本研究通過實驗設計，采用幾個功能分類芯片便可以達到使用高通量表達譜芯片的同樣目的，從而達到事半功倍的效果。功能分類基因芯片采用了預先經過科學驗證的標準和知識為基礎，這對于研究的準確可靠性是十分有益的。因此，可以把功能分類基因芯片的結果比作對基因圖譜進行局部放大的分子圖像。通過這一技術，基因技術革命或許會在生物醫(yī)藥和臨床診治研究中發(fā)揮更大的做用[6-7]。利用功能分類基因芯片以上特性可在藥物和基因之間架起一座橋梁，能從基因水平解釋藥物的作用機制，不僅能為藥物的應用奠定堅實的理論基礎，還能為藥物的進一步開發(fā)和設計提供理論指導。應用基因芯片可以平行測定幾千個基因的表達變化，因而可以用來尋找有意義的藥物作用靶標，監(jiān)測藥物治療過程中基因表達的變化，還可以直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物作用的靶點[8]，有助于快速、準確地鑒別和確認藥物靶標。

本研究結果顯示，CsA和FK506能通過調控一系列基因，發(fā)揮有效的免疫抑制作用。CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調，IL-2、IL15、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IRF4、TFCP2基因顯著下調。FK506作用24 h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調，IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調。這表明盡管CsA和FK506免疫調節(jié)作用靶點存在差異，但二者均能不同程度抑制輔助性T淋巴細胞IL-2、IL15、CCR3、CCR4、CCR5、CD4 、CD86、IRF4的表達，進而特異性抑制機體對移植腎的免疫應答。

對不同免疫抑制劑作用靶點的研究，將有助于進一步了解各種免疫抑制劑對T細胞活化和效應調節(jié)特點，掌握其對T細胞免疫耐受的誘導調節(jié)效應。本研究盡管只提示了CsA和FK506的部分藥理作用，但為臨床深入研究免疫抑制劑的分子藥理作用提供了一個理想模式。在特異性免疫耐受的誘導尚未成功之前，免疫抑制劑仍是腎移植不可替代的治療手段。合理搭配現有免疫抑制藥物，制訂個體化的免疫抑制方案，并探索從單純免疫抑制到免疫調節(jié)的綜合治療措施，仍是一個有效途徑。

[1] Tseng SY, Dustin ML.T cell activation : a multidimensional signaling network[J]. Curr Opin Cell Biol, 2002,14(5):575-580.

[2] Wittmann M, Killig C, Bruder M, et al. Critical involvement of IL-12 in IFN-gamma induction by calcineurin antagonists in activated human lymphocytes[J]. J Leukoc Biol, 2006, 80(1):75-86.

[3] Ito T, Ueno T, Clarkson MR, et al. Analysis of the role of negative T cell costimulatory pathways in CD4 and CD8 T cell-mediated alloimmune responsesinvivo[J]. J Immunol, 2005, 174(11):6648-6656.

[4] Almawi WY, Melemedjian OK. Clinical and mechanistic differences between FK506 (tacrolimus) and cyclosporin A[J]. Nephrol Dial Transplant, 2000, 15(12):1916- 1918.

[5] Sommerer C, Zeier M, Meuer S, et al.Individualized monitoring of nuclear factor of activated T cells-regulated geneexpression in FK506-treated kidney transplant recipients[J]. Transplantation, 2010, 89(11):1417-1423.

[6] Draghici S, Khatri P, Bhavsar P, et al. Onto-Tools, the toolkit of the modern biologist: Onto-Express, Onto-Compare, Onto-Design and Onto-Translate[J]. Nucl Acid Res, 2003, 31(13):3775-3781.

[7] Nelson PJ, Werner T. Pathways and promoter networks analysis provides systems topology for systems biology approaches[J]. Semin Nephrol, 2010, 30(5):477-486.

[8] Bottinger EP, Ju W, Zavadil J. Applications for microarrays in renal biology and medicine[J]. Exp Nephrol，2002,10(2):93-101.

Regulatory Effects of Cyclosporin A and Tacrolimus on Th Immunological Gene Expressions in Renal Transplant Recipients

WEN Jin, JI Zhi-gang, NIU Ji-rui

Department of Urology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

JI Zhi-gang Tel: 010-69156073，E-mail：wjjxmc@163.com

Objective To observe the change of Th immunological gene in renal transplant recipients after the treatment of cyclosporine(CsA) and tacrolimus (FK506).MethodsThe peripheral blood lymphacytes just before and 24 hours after CsA and FK506 treatment were isolated. The total RNA of them were reverse-transcripted and examined by real-time quantity PCR array. The results were analyzed by bioinformatic methods.ResultsThe TLR4, CEBPB, IL4R, IL1R1,IL18R1,and IL1R2 genes were remarkably upregulated, whereas IL-2, CCL5, CD27, CCR5, CCR4, CD4, RPL13A, TGFB3, CD86, CCR3, STAT1, NFATC2IP, IL23A, IL15, IRF4, and TFCP2 were downregulated 24 hours after CsA treatment. The IL18, IL7, PTPRC, TNFSF4, SPP1, GFI1, TLR4, IL13RA1, TNF, INHBA, LAG3, IL13, IL1R1, SOCS5, IL10, YY1, TBX21, FASLG, IL18R1, and IL1R2 genes were remarkably upregulated, whereas IL-2, IL-3, IL-4, IL-6,CCR5, CD4, CD27, CD40LG, IL15, CCR3, CD86, CCR4, and IRF4 were obviously downregulated 24 hours after FK506 treatment .ConclusionCsA and FK506 exert their therapeutic effectiveness by regulating the expressions of a series of target genes.

gene expression regulation; renal transplantation; genechip; cyclosporine; tacrolimus

紀志剛 電話：010-69156073, 電子郵件：wjjxmc@163.com

R392.4

A

1000-503X(2012)06-0563-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.06.005

衛(wèi)生部國際交流與合作中心合作項目基金(IHBCC07-201004)Supported by the Foundation of International Health Exchange and Cooperation Center, Ministry of Health(IHBCC07-201004)

2012-02-15)