牛地方流行性白血病診斷技術(shù)的研究進展

林 立 孔繁德

（廈門出入境檢驗檢疫局，廈門 361012）

牛地方流行性白血?。‥BL），又稱牛病毒性造血細胞組織增生癥、牛淋巴肉瘤、牛惡性淋巴瘤、牛白血病復合癥等，該病是由牛白血病病毒（BLV）引起的牛的一種慢性腫瘤性疾病，該病毒屬于C型致瘤病毒屬，反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）致瘤病毒亞科（Oncoviridae）的RNA病毒，含單股RNA，該屬病毒與C型病毒的形態(tài)和裝配方式十分相似。BLV呈球狀，少數(shù)棒狀，大小不一，平均直徑80～100 nm，有囊膜，囊膜上有纖突。核衣殼呈20面體對稱，內(nèi)為螺旋狀結(jié)構(gòu)的類核體，核內(nèi)攜帶反轉(zhuǎn)錄酶。此病毒的結(jié)構(gòu)蛋白已知有幾種，但主要的是芯髓和囊膜，其中芯髓含有能抵抗乙醚的分子量為2.1萬～2.5萬個的編碼（P）蛋白質(zhì)，主要有P10、P12、P15、P19、P24、P53和P80；囊膜含有對乙醚有感受性的糖蛋白（稱為gp），主要有g(shù)p35、gp45、gp51、gp55、gp60和gp69等[1，2]。在這些蛋白中以gp51和P24的抗原活性最高，用這2種蛋白作為抗原進行血清學試驗，可以檢出特異性抗體。

該病特征為淋巴樣細胞惡性增生、進行性惡病質(zhì)和發(fā)病后的高死亡率。該病最早在1878年由德國首次報道，但直到l969年才由美國的Miller從病牛外周血液淋巴細胞中分離到病毒。此病在我國于1974年首次發(fā)現(xiàn)于上海，此后逐步蔓延到全國其他省市?，F(xiàn)在，該病已成為牛的重要傳染病之一，而且具有進一步蔓延，甚至死灰復燃的趨勢。例如，芬蘭自1996年以來從未發(fā)現(xiàn)BLV病例，1999年芬蘭宣布全國消滅BLV。但是，在2008年4月2日，芬蘭農(nóng)林部向OIE報告了新的BLV疫情通告[3]。因此，為了有效控制BLV的發(fā)生、發(fā)展，有必要對其最新的診j技術(shù)進一步了解。本文將從BLV的流行病學、臨床癥狀、病理變化、臨床診斷與實驗室檢測幾個角度，較為全面的綜述該病研究進展情況。

1 流行病學

感染病牛終生帶毒，成為傳染源。BLV的傳播方式有垂直傳染和水平傳染2種[2，3]。前者包括先天性傳染，母牛通過子宮胎盤將病毒傳遞給胎兒或通過胚胎移植傳播病毒，這種感染可能發(fā)生在免疫力建立之前。犢牛在出生后食初乳之前，體內(nèi)已有病毒和相應的抗體；后者則可能通過血源性傳播（如由病毒污染的器械、獸醫(yī)采血、注射、手術(shù)等）、分泌物性傳播（如鼻腔分泌物、唾液、支氣管-肺泡洗出液、尿液、糞便、子宮沖洗液和精液等）、接觸性傳播（該種傳播實際上多是媒介的傳播）、寄生昆蟲的傳播（寄生昆蟲在吮吸病牛血后，很有可能將感染的淋巴細胞傳播到其他的健康牛）、精液性傳播（如人工輸精，但精源性傳播在BLV的感染中機會很?。?，生物制劑的應用、新生犢牛吃病母牛的初乳、常乳及其制品等，也可傳染發(fā)病。

2 臨床癥狀

Bendixen（1965）曾以臨床病理學方法將牛白血病分為地方流行型牛白血?。ǔ膳Ｐ桶籽。┖蜕l(fā)型牛白血?。倥Ｐ?、胸腺型和皮膚型）。因此，根據(jù)臨床病理學變化，將臨床癥狀分為以下幾型[4]：

2.1 地方流行型

以4～8歲奶牛多發(fā)。多數(shù)感染牛不呈現(xiàn)臨床癥狀，以在血液中存有白血病抗體并出現(xiàn)持續(xù)的淋巴細胞增多癥和異常淋巴細胞為特征。只有生成腫瘤之后，才出現(xiàn)體表或頸淺淋巴結(jié)及內(nèi)臟淋巴結(jié)腫大。直腸檢查可觸摸到腫大的內(nèi)臟淋巴結(jié)。由于腫瘤部位機械性損傷和壓迫作用，使病牛呈現(xiàn)相應的臨床癥狀。病牛食欲不振，體重減輕，發(fā)育不良，全身乏力，泌乳性能明顯降低，可視粘膜蒼白或黃染，前胃馳緩和瘤胃臌氣等。當侵害心臟時，心搏動亢進，心跳加快，心音異常，出現(xiàn)瘤塊壓迫性呼吸、吞咽困難，全身出汗，眼球突出，胸前浮腫，腹瀉，糞如泥樣，有惡臭味，混有血液，尿頻或排尿困難。當骨盆腔及后腹部發(fā)生腫瘤時，病牛呈現(xiàn)共濟失調(diào)，跛行。起立困難，被迫橫臥地上。子宮腫瘤病牛，發(fā)生流產(chǎn)、難產(chǎn)或?qū)遗洳辉小?/p>

2.2 犢牛型

常見于6個月齡以內(nèi)的犢牛或青年牛。淋巴結(jié)腫大，精神不振，全身虛弱無力，個別的病牛發(fā)熱，心動過速，可視粘膜發(fā)紺或黃染。食欲不振，全身出汗，腹瀉，駐立困難而臥地。由于內(nèi)臟發(fā)生的瘤塊壓迫，呈現(xiàn)瘤胃臌氣和充血性心力衰竭等癥狀。

2.3 胸腺型

以7～24個月齡以內(nèi)的小牛多發(fā)。胸腺呈塊狀腫大，其鄰近局部淋巴結(jié)被侵害、腫大，引起頸靜脈怒張、靜脈波動和局部浮腫。有的出現(xiàn)發(fā)熱、瘤胃臌氣等癥狀。

2.4 皮膚型

幼齡牛皮膚出現(xiàn)蕁麻疹樣皮疹，以真皮層為主形成肉瘤。成年牛常于頸、背、臀及大腿等處發(fā)生腫塊。

3 病理變化

3.1 病理組織學檢測

將陽性牛進行病理剖檢，采取淋巴結(jié)、胸骨、心、肺、肝、腎、脾、胃腸等器官和肌肉，用10%的福爾馬林、酒精、AF等固定液固定，石蠟包埋切至3～4 μm和6～8 μm，同一組織塊制成3張切片，分別以H·E染色、PTAH、Lordonit網(wǎng)狀纖維、Van Gesonit膠原纖維染色，對比觀察組織學變化。結(jié)果表明，病牛淋巴結(jié)腫大，遍及全身和各臟器，形成大小不等的結(jié)節(jié)性或彌漫性肉芽腫病灶，尤其真胃、心臟和子宮等為最常發(fā)的器官[4]，同時容易誘發(fā)機會性感染。

3.2 病理形態(tài)學檢測

病理形態(tài)學方法主要檢查淋巴結(jié)、脾、骨髓以及肝、腎、心肌等變化，可發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的淋巴細胞惡性增生，并形成肉眼可見的淋巴細胞肉瘤。

4 實驗室檢測

4.1 血液學檢測

血液學方法是以檢查外周血液中白細胞數(shù)增多為基礎。一般間隔2～3月進行1次補充的血液學分析，直到獲得連續(xù)2次相同的位于正常血液學數(shù)據(jù)的結(jié)果為止。國際上一般采用Bendixen氏檢索表進行BL牛血液學檢查。南京農(nóng)業(yè)大學、上海獸醫(yī)研究所、哈爾濱獸醫(yī)研究所等根據(jù)當?shù)厍闆r和血檢診斷BL時除了要看淋巴細胞絕對數(shù)的增多變化，還必須看是否出現(xiàn)成淋巴細胞或前淋巴細胞等腫瘤細胞及核分裂等現(xiàn)象綜合評定。

4.2 血清學檢測

血清學方法主要以免疫瓊脂擴散檢測（AGID）BLV沉淀抗體，此抗體能在感染后2個月出現(xiàn)，并保留終身。其他的方法主要包括免疫熒光抗體法、補體結(jié)合反應、酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫測定法、血凝試驗、病毒中和試驗、對流免疫電泳技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、親合素－生物素過氧化物酶系統(tǒng)測定等方法。若檢出白血病抗體，即可確診為病毒感染。

4.2.1 單克隆抗體技術(shù)（McAb）

單克隆抗體技術(shù)主要是用來檢測BLV抗原。相較抗原的其他幾種檢測方法，例如依靠電子顯微鏡或免疫電鏡技術(shù)，由于BLV在宿主細胞內(nèi)復制量有限，往往很難觀察到病毒粒子，而逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定，由于操作繁瑣，要求條件高，特異性較差，也很難推廣應用，所以基于單克隆抗體（MAB）的相關(guān)技術(shù)得到了發(fā)展。趙化民等應用抗BLV糖蛋白（gp）抗原MAB探針，采用抗原捕獲試驗（MABACA）檢測BLV抗原，并與AGID和ELISA比較，結(jié)果表明MAB-ACA的敏感性顯著高于AGID技術(shù)，特異性明顯高于ELISA，而且該方法的穩(wěn)定性和重復性好，在BLV抗原檢測方面有著一定的優(yōu)勢[5]。

4.2.2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）

采用酶聯(lián)免疫吸附檢測血清主要針對的是抗gp51和p24抗體。間接法是先將提純的抗原包被到固相載體，再加試驗血清和特異性lgG結(jié)合物；阻斷法是利用試驗血清中的抗體干擾或阻斷標準抗原-抗體反應。Gutierrez等[6]研制了一種新的阻斷ELISA，該方法以gp51為抗原，對牛血清和乳樣品中BLV抗體的檢測具有特異和敏感的特點。趙顯文等用免疫親和層析提純技術(shù)獲取高純度的BLV抗原，建立一種快速特異的斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（Dot-ELISA），用于檢測BLV血清抗體。其檢測結(jié)果陽性者完全覆蓋并高于ID試驗的檢出率，與ELISA法測得陽性結(jié)果完全符合。該法比ID試驗高5.6%，并可提前60多個小時報告結(jié)果；比ELISA法亦可提前10幾個小時得出結(jié)果。該法不需要特殊儀器設備，是一種特異性強，敏感性良好而且快速的免疫學檢測方法[7]。目前，關(guān)于牛白血病ELISA檢測試劑盒的研究與開發(fā)也得到了進一步的推廣與應用[8]。

4.3 分子生物學檢測方法——聚合酶鏈式反應（PCR）

目前，分子生物學檢測方法由于具有高度敏感的特點，在病原檢測里面占據(jù)重要地位。聚合酶鏈式反應是比較靈敏的直接檢測BLV前病毒的方法之一。Naif等[9]采用PCR檢測BLV，可從感染宿主檢測到100 ng前病毒DNA，使本試驗的敏感性提高了2個對數(shù)級數(shù)，而且，無論是在淋巴細胞還是在腫瘤細胞，以及各個感染時期都可檢出前病毒DNA。Agresti等[10]應用PCR診斷初生牛犢BLV，DNA擴增靶物采用BLV前病毒基因組中位于gag和env基因區(qū)的2個片斷（分別為277 bp和220 bp），參照BLV前病毒核苷酸序列設計合成寡核苷酸引物（20 bp）和雜交探針（29 bp），進行PCR試驗。結(jié)果表明，PCR技術(shù)診斷犢牛出生前后感染BLV是可靠的。其他的一些新型PCR技術(shù)也得到了開發(fā)。例如，巢式PCR（Nested PCR），利用2套PCR引物（巢式引物）進行2輪PCR擴增反應，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與2套引物都互補的模板很少）增加了檢測的敏感性；同時2對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。該方法能從兩個BAT-BLV細胞內(nèi)檢測出BLV的前病毒DNA形式[11]。劉志玲等[12]采用LUXTM新型熒光PCR技術(shù)原理，設計并合成1對單標記LUXTM熒光引物，建立了LUXTM熒光PCR和RT-PCR方法，可快速檢測BLV前病毒DNA和病毒RNA。敏感性實驗表明，LUXTM熒光RT-PCR對RNA前病毒的檢測敏感性達0.49 ng/μL，熒光PCR對pTblv-gp51重組質(zhì)粒的檢測敏感性可達0.138拷貝，比OIE規(guī)程的巢式，PCR方法高104倍以上。

4.4 其他

血液學、血清學、病理形態(tài)學以及組織學檢測除了以上常規(guī)操作外，還存在一些其他的診斷檢測手段，現(xiàn)分述如下：

4.4.1 色氨酸代謝

謝占武等人探討了地方流行性牛白血病與色氨酸（Trp）代謝的關(guān)系。結(jié)果表明，經(jīng)熒光法測定瓊擴陽性牛、羊血清和牛奶中的Trp含量明顯高于瓊擴陰性對照組，此結(jié)果與原蘇聯(lián)學者的報道一致，表明可采用此法作為生前診斷BLV的一種生化指標。由于該法檢測用量少，操作簡單，只要有熒光分光光度計即可應用，3 h內(nèi)即可得出準確結(jié)果[13]。

4.4.2 膠體金免疫層析法

宋陽威等以膠體金標記的羊抗牛IgG（Fc）抗體作為標記抗體，將純化的His-gp51重組蛋白和羊抗牛IgG分別標記于硝酸纖維素膜上作為檢測線和質(zhì)控線，各部件按序裝配形成快速診斷試紙條。對22份樣本分別用試紙條和ELISA試驗進行檢測，2種方法的陽性符合率為88.9%（8/9），表明該研究建立的膠體金免疫層析方法簡便、快捷，具有較好的特異性和一定的敏感性，適宜基層初篩診斷和現(xiàn)場應用[14]。

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