不同動(dòng)物宿主小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離及結(jié)果分析

肖玉春，梁俊容，古文鵬，邱海燕，王樹(shù)坤，羅隆澤，王化彬，景懷琦，王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y．e）是引起國(guó)際社會(huì)廣泛關(guān)注的一種新發(fā)食源性致病菌。是能在冷藏溫度下生長(zhǎng)的少數(shù)幾種腸道致病菌之一。近來(lái)國(guó)內(nèi)外多次報(bào)道相關(guān)的人群感染。甚至是暴發(fā)流行［1－2］。它除引起胃腸道癥狀外，還能引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結(jié)締組織等疾患，甚至可引起敗血癥，造成死亡。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分布廣泛，血清型眾多，有6個(gè)生物型，目前研究認(rèn)為我國(guó)僅有O∶3、O∶9兩個(gè)血清型具有致病性［1－3］，生物型以2型、3型為主［4］，而非致病菌株以生物1A型為主。致病性菌株毒力基因分布特征為：ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－或ail＋ystA＋virF－yadA－ystB－，而非致病性菌株毒力基因分布特征為：ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ 或ail－ystA－virF－yadA－ystB－［5］。

為研究我國(guó)不同地區(qū)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分布狀況及血清型、生物型和毒力基因的特征，對(duì)我國(guó)2010年云南、四川、黑龍江、內(nèi)蒙4個(gè)地區(qū)部分宿主動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)本采集，冷增菌后進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離培養(yǎng)、并對(duì)分離到的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株進(jìn)行血清分型、生物分型、毒力基因檢測(cè)。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本、菌株來(lái)源 本科室承擔(dān)國(guó)家科技部重大專項(xiàng)和衛(wèi)生部全國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作，因此我們對(duì)一些省份進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌病原學(xué)監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)3 649份標(biāo)本均來(lái)自我國(guó)云南、四川、黑龍江、內(nèi)蒙古省區(qū)。

參考菌株：國(guó)際參考菌株52203（O∶3血清型）、52211（O∶8血清型）、52212（O∶9血清型）、52206（O∶5）血清購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1．2 主要試劑及儀器 耶爾森增菌緩沖液PBS、改良克氏雙糖瓊脂、半固體瓊脂均購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司。尿素培養(yǎng)基購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社。耶爾森麥康凱選擇性培基由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，API－20E試條為法國(guó)梅里埃生物公司生產(chǎn)，分型血清O∶3、O∶8、O∶9單克隆抗體由本研究室研究，O∶5血清型分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社，生物分型試劑購(gòu)自丹麥ROSCO公司，聚合酶鏈反應(yīng)PCR所有試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。PCR儀由德國(guó)SENSO公司生產(chǎn)，型號(hào)為L(zhǎng)abCycler standard plus，讀膠儀為BIORAD公司的Gel Documentation 2000。

1．3 菌株分離 將在4℃放置20d的標(biāo)本增菌緩沖液搖均，取少量平行接種于耶爾森選擇性培基平板，培養(yǎng)兩天后，挑可疑菌落接種于改良克氏雙糖瓊脂培基，取雙糖陽(yáng)性、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)氣或少量產(chǎn)氣菌株接種于尿素培基，尿素陽(yáng)性菌株分別接種于2管半固體培基于25℃、37℃各培養(yǎng)48h，25℃動(dòng)力陽(yáng)性、37℃動(dòng)力陰性菌株進(jìn)行Api20E生化鑒定。

1．4 血清凝集試驗(yàn) 將分離菌株的純培養(yǎng)物用生理鹽水制成濃厚菌懸液做血清玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)生理鹽水做自然凝集對(duì)照試驗(yàn)。

1．5 生物分型 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌根據(jù)以下生化反應(yīng)被分為生物1A、1B、2、3、4、5共6個(gè)生物型［6］見(jiàn)表1。

脂酶代謝反應(yīng)鑒定：將待鑒定菌株接種于含有1%吐溫80、0．01%氯化鈣（CaCl2·H2O）的腦心浸液平板（或胰蛋白胨大豆肉湯平板），35℃培養(yǎng)4d，菌落周圍形成白色渾濁結(jié)晶物為陽(yáng)性。

七葉苷代謝反應(yīng)鑒定：將待測(cè)菌株點(diǎn)種于膽鹽－七葉苷平板（oxiod），置于25℃培養(yǎng)24h。生物1A型菌株分解七葉苷，使接種點(diǎn)周邊培養(yǎng)基變黑色；而其他生物型菌株則不變色。

其他生化指標(biāo)鑒定使用生化反應(yīng)藥片（丹麥Rosco公司）。按照分型藥片使用說(shuō)明進(jìn)行生化鑒定：刮取新鮮培養(yǎng)物置入裝有生理鹽水比濁管中，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷嶂瞥蒓D值為3．3～3．5菌懸液（吡嗪酰胺酶需用三蒸水制備菌懸液），分裝到1．5mL eppendorf管，每管250μL，放入需鑒定的生化指標(biāo)藥片，25℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察顏色變化判讀結(jié)果。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型Tab．1 Biotyping tor Yersinia enterocolitica

1．6 毒力基因鑒定 用文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行毒力基因檢測(cè)以確定菌株的致病性，檢測(cè)的基因?yàn)樾∧c結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因特異性引物：粘附侵襲位點(diǎn)基因（ail）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素基因（ystA）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物1A型攜帶的腸毒素基因（ystB）、粘附素（yadA，涉及到自凝、血清抗性和粘附）、yop調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄活化作用（virF）［3，7－9］，引物及擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物Tab．2 The primers used in our study

2 結(jié) 果

2．1 標(biāo)本分離菌株結(jié)果 將2010年來(lái)自云南、四川、黑龍江、內(nèi)蒙古省區(qū)的3 386份家禽家畜、鼠類、旱獺等各類宿主標(biāo)本進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離，結(jié)果分離出出134株小腸結(jié)炎耶爾森氏菌，分離率為3．96%。鼠、豬和旱獺的分離率分別為3．41%（78／266）、6．28%（53／844）和4．05%（3／74），分別占比例為58．21%、39．55%和2．24%．而檢查24頭牛、72頭羊、5只雞、3頭驢、2只鵝和個(gè)1只鴨、兔均陰性。

2．2 菌株血清型，生物型結(jié)果 對(duì)分離得到的134株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌進(jìn)行血清分型和生物分型，結(jié)果有30株為O∶3血清型，生物型全部為3型；O∶8血清型菌株有14株，O∶5血清型5株，生物型全為1A型；未知血清型85株，其中84株為生物1A型，1株為生物2型。

2．3 菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果 我們對(duì)134株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ystA、ail、virF、yadA、ystB五個(gè)基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示30株O∶3血清型菌株均攜帶ystA、ail、virF、yadA基因，而另外104株菌除了3株毒力基因全部陰性外，其它101株均攜帶ystB基因。這與我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌致病性菌株與非致病性菌株的血清型、毒力基因分布狀況一致。我國(guó)四省134株不同血清、生物型菌株的毒力基因分布狀況見(jiàn)表3。

表3 142小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因分布狀況Tab．3 The virulence gene of Yersinia enterocolitica

3 討 論

此次調(diào)查從3 386份各類宿主標(biāo)本中分出134株小腸結(jié)炎耶爾森氏菌，總分離率為3．96%。各類宿主小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分離率高低依次為豬（6．28%）、旱獺（4．05%）、鼠類（3．41%），顯示豬為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要宿主，這與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致［10］。所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)豬帶菌情況的監(jiān)測(cè)工作，防止進(jìn)食污染的豬肉及其制品而感染小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。在牛、羊、雞、驢、鵝、鴨、兔糞便標(biāo)本中均未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，這可能與此次檢測(cè)的標(biāo)本數(shù)量不夠多有關(guān)。但以往大量的調(diào)查表明牛、鳥(niǎo)、魚(yú)、狗、貓、羊、兔等家禽家畜可攜帶該菌［8］，應(yīng)引起重視。分離到的134株菌中致病性菌株有30株（22．39%），全部為O∶3血清型，生物3型且均來(lái)自豬中。進(jìn)一步證實(shí)豬為人類感染小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的主要來(lái)源。歐美等國(guó)O∶3血清型菌株主要是生物4型。非致病菌株以生物1A型為主占99．04%。由于我國(guó)分型血清不完全，還有85株未知血清型菌株。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－）30株（22．39%），PCR結(jié)果顯示全部攜帶毒力質(zhì)粒。非致病性菌株104 株，其 中 （ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ ）101 株（75．37%），另外有（ystA－ail－virF－yadA－ystB－）3株（2．24%）。

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