鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM－1基因序列分析及表達(dá)

陳 碩，邱少富，夏力亮，王中強(qiáng)，劉 軍，柳 楠，祝令偉，孫 洋，宋宏彬，馮書章

NDM－1最先報(bào)道于2010年8月11日，英國(guó)醫(yī)學(xué)界宣稱南亞出現(xiàn)了一種新型細(xì)菌，幾乎對(duì)所有抗生素都有抗藥性，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。確切地說(shuō)，NDM－1不是一種細(xì)菌，而是一種新發(fā)現(xiàn)的基因blaNDM－1編 碼 的 金 屬－β－內(nèi) 酰 胺 酶 （metallo－β－lactamase，MBL）。因?yàn)槭状尾±窃谟《刃碌吕镝t(yī)院住過(guò)院的瑞士人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，所以一些西方醫(yī)學(xué)者把它叫做“新德里金屬－β－內(nèi)酰胺酶1（New Delhi metallo－β－lactamase－1，NDM－1）”。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶編碼blaNDM－1基因的耐藥質(zhì)粒不僅可以在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，而且能使所在宿主菌成為可以耐受幾乎全部抗生素的超級(jí)細(xì)菌［1］。攜帶此酶的菌株對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，僅對(duì)多黏菌素及米諾環(huán)素衍生物—替加環(huán)素敏感［2］。由于該基因多定位于質(zhì)粒，容易通過(guò)接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)在不同細(xì)菌間傳遞，一旦病原菌獲得該基因，也會(huì)產(chǎn)生多重耐藥表型，其感染將變得更加難以治療。據(jù)報(bào)道，新德里的這位病人就同時(shí)感染了攜帶blaNDM－1基因質(zhì)粒的肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌［3］。目前，這種可移動(dòng)元件攜帶的高水平廣譜抗性的發(fā)展趨勢(shì)引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。

本研究菌株NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌分離自廈門某醫(yī)院一肺癌病人，從其痰培養(yǎng)分離出多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，并檢出NDM－1。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株的耐藥譜進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其blaNDM－1基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及序列分析，研究其耐藥性的分子機(jī)制，為耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、E．coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；DL2000DNA Marker、質(zhì)粒pMD18－T購(gòu)自大連寶生物公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生物公司；Vitek32微生物鑒定系統(tǒng)為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；美洛培南為浙江海正制藥廠生產(chǎn)。

1．2 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌菌株鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn) 使用Vitek32微生物鑒定系統(tǒng)，以革蘭陰性菌鑒定卡GNI＋進(jìn)行菌株鑒定，藥敏卡GNS－506進(jìn)行耐藥譜測(cè)定。

1．3 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM－1基因的 PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù) GenBank的blaNDM－1基因（pKpANDM－1，登錄號(hào)FN396876．1）編碼序列設(shè)計(jì)兩條引物 LE－F：5′－GGCGTTAGATTGGCTTACACCATTAGAG－3′和 LE－R：5′－CAGGCAACAGCCGAACGAGC－3′，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA為模板，按照以下條件擴(kuò)增blaNDM－1基因：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將其與pMD18－T載體于4℃過(guò)夜連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E．coli DH5α，涂布于含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB平板篩選。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18－T：：blaNDM－1送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1．4 美洛培南對(duì)NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、重組E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌 E．coli DH5α最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 將菌液過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋1 000倍，每孔100μL。美洛培南濃度從1孔至14孔分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25、0．015 625μg／mL，15孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照。密封，35℃溫箱培養(yǎng)16～20h。判斷標(biāo)準(zhǔn)以孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。

2 結(jié) 果

2．1 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌菌株鑒定與藥敏結(jié)果Vitek32微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定此菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌。藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌廈門株藥敏結(jié)果Tab．1 The antimicrobial susceptibility profile of NDM－1 Acinetobacter baumannii

2．2 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM－1基因的PCR擴(kuò)增、克隆與序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖1所示，結(jié)果擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的片段。blaNDM－1基因克隆到pMD18－T載體后進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，說(shuō)明blaNDM－1基因已克隆到載體中。

圖1 PCR擴(kuò)增 NDM－1（廈門株）blaNDM－1基因Fig．1 Amplification of blaNDM－1M：DL2000DNA Marker；1：PCR products

測(cè)序結(jié)果與香港分離的大腸桿菌HK－01質(zhì)粒pNDM－HK及印度肺炎克雷伯氏菌 KP－05－506質(zhì)粒pKpANDM－1攜帶的blaNDM－1基因進(jìn)行Blast序列比對(duì)。結(jié)果顯示，NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌與HK－01的blaNDM－1基因序列同源性為100%；與 KP－05－506相比，在blaNDM－1和trpF之間有24bp的插入，這一段插入的序列除了存在于香港HK－01株外，還存在于 NDM－1大腸桿菌 DVR22（西班牙株）、NDM－1大腸桿菌271（澳大利亞株）、NDM－1銅綠假單胞菌（塞爾維亞株）、NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌161／07（德國(guó)株）和 NDM－1大腸桿菌 Dok01（日本株），該段序列均位于blaNDM－1基因下游，功能未知。序列比對(duì)結(jié)果如下。

圖2 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD18－T：：blaNDM－1Fig．2 Identification of plasmid pMD18－T：：blaNDM－1by restriction enzyme digestionM：DL2000DNA Marker；2：plasmid fragments digested by EcoRI and HindⅢ

2．3 最小抑菌濃度的測(cè)定 美洛培南對(duì)NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌E．coli DH5α最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果為NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌廈門株：128μg／mL；E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）：32μg／mL；E．coli DH5α：0．03125μg／mL。

3 討 論

金屬－β－內(nèi)酰胺酶基因可通過(guò)染色體和轉(zhuǎn)移基因在不同細(xì)菌間傳遞，造成廣泛耐藥，多種重要的獲得性 MBLs（IMP，VIM，SPM，GIM，SIM）都是由質(zhì)粒介導(dǎo)和可轉(zhuǎn)移基因編碼［4］。獲得性 MBLs不僅分布于腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌中，還可通過(guò)質(zhì)?；蛘献釉诓煌?、種屬間傳播［5］，因此產(chǎn)獲得性MBLs的革蘭陰性桿菌被公認(rèn)為極其重要的多重耐藥病原體［6］，給感染性疾病的臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，對(duì)氨基糖苷類抗生素及喹諾酮類抗生素敏感。β－內(nèi)酰胺類是處理嚴(yán)重傳染病中主要的抗生素，與碳?xì)涿瓜╊惪股貐f(xié)同應(yīng)用效果更好，由于碳?xì)涿瓜╊愒趥魅静≈委熒洗罅渴褂?，是?dǎo)致超廣譜β－內(nèi)酰胺酶在腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生和擴(kuò)散的主要原因［6］。

本實(shí)驗(yàn)將NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌編碼碳青霉烯酶的blaNDM－1結(jié)構(gòu)基因及其上下游調(diào)控序列克隆轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E．coli DH5α。序列分析結(jié)果表明，該菌株blaNDM－1基 因 與 NDM－1 大 腸 桿 菌 香 港 株blaNDM－1基因序列同源性為100%，其結(jié)構(gòu)基因與NDM－1克雷伯氏菌印度分離株同源性也是100%，但在blaNDM－1結(jié)構(gòu)基因的下游和trpF之間有24bp的插入片段。這段24bp的插入片段至少在耐藥基因溯源上具有重要價(jià)值，還極有可能具有特殊的生物學(xué)意義，值得深入研究。

野生菌株及重組菌株對(duì)美洛培南（碳青霉烯類抗生素）最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果顯示，獲得了blaNDM－1基因的E．coli DH5α重組菌株對(duì)美洛培南的MIC升高了256倍，證明了blaNDM－1基因是碳青霉烯類抗生素耐藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）對(duì)美洛培南的 MIC值仍然比NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌低4倍，可能的原因是該株NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌還存在其他耐藥機(jī)制，能夠協(xié)同抵抗此類抗生素的作用。

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是不動(dòng)桿菌屬中最常見(jiàn)的一種革蘭陰性球桿菌，屬于條件致病菌，常常引起醫(yī)院相關(guān)感染［7］。從醫(yī)院環(huán)境分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，往往對(duì)多種抗生素耐藥，常被稱為“革蘭氏陰性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Gram－negative MRSA）”［8］。 因 此，這 些 獲 得 了NDM－1質(zhì)粒的鮑曼不動(dòng)桿菌，可使醫(yī)院發(fā)生相關(guān)感染的危害程度增加，治療更加困難。由于blaNDM－1基因在多種腸桿菌科細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)［9］，說(shuō)明此基因可以在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，這樣就可能使得更多的細(xì)菌攜帶此基因。因此，攜帶blaNDM－1基因的細(xì)菌有可能給人類造成重大的健康威脅。

［1］孫明偉，鄭焙文，高福，等．人類與病原菌的軍備競(jìng)賽：NDM－1耐藥基因與 超 級(jí) 細(xì) 菌 ［J］．生 物 工 程 學(xué) 報(bào)，2010，26（11）：1461－1472．

［2］Rose WE，Rybakh MJ．Tigecyeline：first of new class of antimicrobial agents［J］．Phannacotherapy，2006，26（8）：1099－1110．

［3］Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of new metallo－beta－lactamase gene，bla（NDM－1），and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetc structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14from India［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5046－5054．

［4］Samuelsen O，Castanheira M，Walsh TR，et al．Kinetic charac－terization of VIM－7，a divergent member of the VIM metallo－beta－lactamase family［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（8）：2905－2908．

［5］Murphy TA，Simm AM，Toleman MA，et al．Bioch emical Characterization of the Acquired Metallo－beta－Lactamase SPM－1 from Pseudomonas aeruginosa［J］．Ant imicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（2）：582－587．

［6］Lee K，Yum J H，Yong D，et al．Novel acquired metallo－betalactamase gene，blaSIM－1，in a class 1integron from Acinetobacte r baumannii clinical isolates from Korea［J］．Antimicrob A－gents Chemother，2005，49（11）：4485－4491．

［7］Sobel JD．Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis［J］．Clin Infect Dis，1992，14（Suppl1）：S148－153．

［8］Nalbanski B，Tsekova K，Ivanov S．Candidiasis and birth canal in Juries［J］．Akush Ginekol（Sofiia），2002，41：23－25．

［9］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）．Detection of Enterobacteriaceae isolates carrying metallo－beta－lactamase－United Statea［R］．MMWR Wkly Rep，2010，59（24）：750．