腸出血性大腸桿菌粘附機(jī)理的研究進(jìn)展＊

崔 強(qiáng)，周志江，劉建青，肖華志

EHEC是一群重要的傳染性病原菌，有若干血清型，其中以 O157∶H7血清型菌株為主［1］。EHEC O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、較強(qiáng)的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險(xiǎn)性等特點(diǎn)，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。2011年5月中旬，一場(chǎng)由EHEC細(xì)菌引發(fā)的疫情在德國(guó)北部集中暴發(fā)。由于廣譜β－內(nèi)酰胺酶CTX－M等質(zhì)粒基因的作用，這些細(xì)菌對(duì)第三代頭孢菌素等抗生素有耐受性［2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截至2011年6月24日，已報(bào)告3 043例EHEC O104∶H4感染病例，16例死亡，HUS病例877例，造成32例死亡。除德國(guó)外，美國(guó)、英國(guó)、瑞典、加拿大、新西蘭等15個(gè)國(guó)家也有上述病例報(bào)告［3］。

EHEC的主要致病因子有兩個(gè)，一是它產(chǎn)生毒力極強(qiáng)的志賀毒素，一是它具有粘附到上皮細(xì)胞的能力，粘附是該菌引起發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。通常出血性大腸桿菌O157引起人或動(dòng)物的感染必須粘附到腸粘膜上皮細(xì)胞，然后在此定居、釋放外毒素，從而引起疾?。?］。目前，關(guān)于EHEC的粘附機(jī)理比較公認(rèn)的是緊密素起重要作用，但僅僅依靠緊密素仍不足以引起粘附，除緊密素外，還從EHEC中鑒定出許多其他粘附因子。本文將就各類粘附因子進(jìn)行分類闡述，并總結(jié)其粘附機(jī)理及研究進(jìn)展。

1 粘附因子

1．1 緊密素（Intimin） 緊密素是由eae基因編碼的94～97kDa的外膜蛋白，是腸道的粘附因子。緊密素既為AE損傷過程中所必需的，又介導(dǎo)細(xì)菌在腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣上粘附定居，避免細(xì)菌被腸道黏膜分泌液及腸蠕動(dòng)清除［5］。

緊密素由表現(xiàn)同源性的N端和表現(xiàn)多肽受體結(jié)合活性的C端組成。此粘附素有不同的抗原亞型，包括緊密素α，β，γ，δ和ε。緊密素α的C端280個(gè)氨基酸構(gòu)建成3個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域，其中由β長(zhǎng)帶夾心結(jié)構(gòu)組成的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin Super Family，IgSF）類似。結(jié)合緊密素受體的活性片段貫穿這個(gè)類IgSF結(jié)構(gòu)域和鄰近的類凝集素結(jié)構(gòu)域，而緊密素受體結(jié)合位點(diǎn)在類凝集素結(jié)構(gòu)的頂端殘基上［6］。

緊密素不僅能與緊密素受體相互作用，也可以與宿主受體結(jié)合。緊密素的不同抗原亞型能夠決定細(xì)菌在宿主體內(nèi)的不同組織嗜性，而對(duì)特定位點(diǎn)的突變研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了決定組織嗜性的關(guān)鍵殘基［7］。

1．1．1 AE損傷（Attaching／Effacing lesion） 緊密素是通過AE損傷過程發(fā)揮粘附作用的。AE損傷是指細(xì)菌能夠附著在腸上皮細(xì)胞表面的微絨毛上，并將腸上皮微絨毛抹平，使細(xì)菌粘附處正下方的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，同時(shí)發(fā)生絲狀肌動(dòng)蛋白的聚集。細(xì)菌在粘附過程中依附在細(xì)胞表面的基座結(jié)構(gòu)上，此結(jié)構(gòu)能延伸到細(xì)胞外10μm處［8］（圖1）。

圖1 AE損傷（透射電鏡圖像）［8］B：附著的大腸桿菌菌體；P：宿主細(xì)胞底座結(jié)構(gòu)；M：宿主細(xì)胞微絨毛Fig．1 AE lesion（TEM images）B：Adhesive E．coli；P：The base structure of host cells；M：Microvilli of host cells．

1．1．2 Tir（Translocation intimin receptor） AE損傷的形成需要一種叫Tir的蛋白，其由Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌后借助EspA、EspB、EspD轉(zhuǎn)位于宿主細(xì)胞，表現(xiàn)為緊密素受體功能。緊密素與Tir結(jié)合后可引起宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排而形成特異性損害。Tir與緊密素的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域一起在宿主細(xì)胞質(zhì)形成一個(gè)發(fā)卡拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［9］。

1．2 LEE編碼蛋白和非LEE編碼蛋白 EHEC的染色體上有一個(gè)43kb的腸細(xì)胞脫落毒力島（Locus of enterocyte effacement，LEE）。LEE不僅編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EspA，EspB和EspD，還編碼效應(yīng)蛋白EspF，EspG，EspH，EspZ，Tir和 Map。某些非LEE編碼蛋白（non－LEE－encoded，Nle），包括周期抑制蛋白（Cycle inhibiting factor，Cif）、Tccp（Tircytoskeleton coupling protein）、EspJ 和 NleA、NleC、NleD，同樣由Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌。

1．2．1 EspA／B／D 作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，EspA 形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)的延伸絲狀結(jié)構(gòu)。此絲狀結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)將細(xì)菌分泌的包括Tir在內(nèi)的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)［10］。EspB和EspD在此轉(zhuǎn)運(yùn)過程中同樣不可或缺，他們?cè)谒拗骷?xì)胞膜上形成孔，與EspA結(jié)合，成為EspA絲狀結(jié)構(gòu)的末梢［11］。

1．2．2 EspF／G／H，Map EspF 與 Map共同作用，破壞跨膜阻抗并協(xié)助線粒體膜電位的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中 Map還可以形成絲足［12］。而EspG與EspH共同作用于對(duì)宿主細(xì)胞骨架的控制和破壞。其中有研究表明EspG能降低細(xì)菌粘附能力［13］。

1．2．3 Tccp 在大腸桿菌O157∶H7形成的AE損傷中，宿主細(xì)胞骨架成分（F－肌動(dòng)蛋白和α－肌動(dòng)蛋白）的補(bǔ)充依靠另外一種被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白—Tir細(xì)胞骨架偶聯(lián)蛋白（TccP）［14］。在體外人類HeLa細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，tccp的突變表達(dá)產(chǎn)物盡管粘附得很好，卻無法聚集纖維型肌動(dòng)蛋白。然而在牛的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，tccp的突變表達(dá)產(chǎn)物可以與典型的基座結(jié)構(gòu)結(jié)合導(dǎo)致AE損傷。這說明基座結(jié)構(gòu)的形成在體內(nèi)和體外有不同，可能的原因包括宿主細(xì)胞的差異和效應(yīng)因子在體內(nèi)環(huán)境中所起的作用［15］。

1．2．4 EspJ EspJ能阻止巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并不參與AE損傷過程［16］。Dahan等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明EspJ能通過阻止宿主的免疫應(yīng)答來提高定植能力，但是有限的可用證據(jù)亦表明EspJ或許能降低細(xì)菌存活率［17］。

1．2．5 Cif Cif蛋白由λ形噬菌體編碼，許多EHEC和EPEC菌株攜帶功能性Cif或Cif的變異體。它可在HeLa細(xì)胞中觸發(fā)一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的病變效應(yīng)，表現(xiàn)為局灶性粘附的逐步聚集，應(yīng)力纖維的裝配，以及對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用［18］。有學(xué)者提出Cif能在短時(shí)間對(duì)大量細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生抑制作用，比如對(duì)腸上皮細(xì)胞，這很可能會(huì)輔助細(xì)菌定居和存活繁殖［19］，不過相關(guān)研究尚未得到發(fā)表。

1．2．6 NleA，NleC，NleD NleA／EspI蛋白由大腸桿菌O157∶H7基因組的噬菌體CP933P編碼，集中在宿主細(xì)胞高爾基體內(nèi)，干擾其分泌機(jī)制［20－21］。Marche｀s等 人 發(fā) 現(xiàn) 了 NleC 蛋 白 和 NleD蛋白，并將野生型大腸桿菌O157∶H7菌株及nleC，nleD的等基因突變表達(dá)產(chǎn)物分開口服于羊體內(nèi)，在隨后7d里，羊群所排泄的糞便中菌體的密度基本一樣，可得出結(jié)論：NleC和NleD對(duì)大腸桿菌O157∶H7在羊體內(nèi)的粘附和定居都并非必需的［22］。

1．3 菌毛 菌毛是細(xì)菌的一種蛋白性突起，對(duì)宿主上皮細(xì)胞有粘附作用。這對(duì)細(xì)菌對(duì)宿主的入侵、定居從而打開侵襲的通道起著至關(guān)重要的作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌O157∶H7中至少有16個(gè)菌毛基因簇的表型［23］。Roe等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，由于受到其調(diào)控子‘fim開關(guān)’中一段大小為16bp的DNA缺失的影響，EHEC O157∶H7無法表達(dá)Ⅰ型菌毛［24］。

長(zhǎng)極菌毛（Long polar fimbriae，LPF）在大腸桿菌O157∶H7的粘附過程中成為潛在的決定因素。大腸桿菌O157∶H7中有兩個(gè)lpf基因，他們雖與鼠傷寒沙門氏菌中的lpf位點(diǎn)同源，但并不完全相同［25］。其中任意一個(gè)lpf基因位點(diǎn)的突變都能改變大腸桿菌O157∶H7在人體腸道中的粘附嗜性，即粘附范圍反常地從回腸小囊上皮細(xì)胞（野生型粘附嗜性）擴(kuò)大到其他小的腸上皮細(xì)胞區(qū)域［26］。

在特定的培養(yǎng)條件下，Ⅳ型菌毛和‘F9’菌毛可以從大腸桿菌O157∶H7中提取出來。Ⅳ型菌毛可以協(xié)助大腸桿菌O157∶H7粘附到人、牛體內(nèi)和豬內(nèi)臟中，但是現(xiàn)在還缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［27］。在牛體內(nèi)對(duì)其突變體的研究尚未確認(rèn)‘F9’菌毛在細(xì)菌粘附中的作用［28］。發(fā)酵山梨醇的EHEC O157∶H菌株能表達(dá)只在厭氧條件下才由質(zhì)粒編碼的菌毛，它能提高細(xì)菌對(duì)人體腸道上皮細(xì)胞的粘附能力［29］。

引發(fā)2011年德國(guó)大規(guī)模疫情的菌株被認(rèn)為是EHEC，卻能夠表達(dá)腸道聚集粘附性大腸桿菌（EAEC）的聚集粘附型菌毛［30］。有學(xué)者利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象是大腸桿菌基因組可塑能力的表現(xiàn)，它得到了不同的大腸桿菌致病型（EAEC，EHEC和ExPEC）的基因［31］。經(jīng)研究，這些基因是通過大腸桿菌水平基因轉(zhuǎn)移和同源性重組擴(kuò)展到各個(gè)血清型的［32］。

1．4 脂多糖和外膜蛋白A 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在粘附中具有一些間接的作用。Paton等研究發(fā)現(xiàn)LPS的抗體封閉了O157粘附到Henle407細(xì)胞，但用LPS的抗體對(duì)Henle407細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理并不能封閉細(xì)菌的粘附，所以推測(cè)LPS耐受抗性的粘附是通過位阻機(jī)理實(shí)現(xiàn)的［33］。而另一些體外研究發(fā)現(xiàn)LPS缺失突變株能高度粘附HEp－2細(xì)胞，暗示LPS可能遮蓋了細(xì)菌表面的粘附結(jié)構(gòu)，或者LPS的缺乏導(dǎo)致了細(xì)胞的理化特性如表面的電荷或疏水性發(fā)生改變。

外膜蛋白OmpA（Outer membrane protein A）廣泛的存在于原核生物的細(xì)胞外膜中，具有β－桶狀結(jié)構(gòu)。Torres等學(xué)者通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)OmpA作為外膜孔蛋白在EHEC O157∶H7粘附Hela細(xì)胞和Caco－2細(xì)胞的過程中起重要作用，但是在體內(nèi)是否有同樣的作用不得而知［34］。

2 結(jié) 語

EHEC的粘附是一個(gè)復(fù)雜的過程，其精確的粘附機(jī)理還不太不清楚。隨著對(duì)細(xì)菌和宿主相互關(guān)系研究的深入，將來可能還會(huì)有新的粘附因子被發(fā)現(xiàn)。最新的研究多集中于NleC、NleE、EspP等新近發(fā)現(xiàn)而其粘附機(jī)理不甚明了的粘附蛋白以及HCP等參與菌毛粘附的粘附素。各粘附因子的作用和研究狀況的總結(jié)如表1所示。研究EHEC的粘附機(jī)理有3個(gè)重要意義：EHEC致病機(jī)理的理論得到進(jìn)一步完善，更有利于預(yù)防和控制該菌引起的疾?。粚?duì)細(xì)菌的血清型鑒定和診斷有重要意義；為EHEC疫苗的開發(fā)提供新思路，有助于我們研制用于預(yù)防的疫苗。

表1 EHEC粘附因子總結(jié)Tab．1 Summary of EHEC adhesion factors

續(xù)表

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