MLVA方法在軍團菌分子分型中的應(yīng)用評價＊

朱兵清，任紅宇，周海健，關(guān) 紅，邵祝軍

MLVA方法在軍團菌分子分型中的應(yīng)用評價＊

朱兵清，任紅宇，周海健，關(guān) 紅，邵祝軍

目的探討MLVA方法在軍團菌分型中的可應(yīng)用性。方法選用文獻報道的9個軍團菌VNTR位點，對我國環(huán)境水中分離的81株Lp1型軍團菌菌株和2株參考菌株進行分子分型研究，并與PFGE和SBT分型結(jié)果進行了比較。結(jié)果81株分離菌株9個VNTR位點的等位基因型別數(shù)分別為6，3，4，2，3，3，2，4和7，其中部分菌株的某些位點無擴增產(chǎn)物或產(chǎn)物為非目的片斷。7個位點PCR產(chǎn)物具有重復(fù)單元；Lpms3位點PCR產(chǎn)物無重復(fù)單元；Lpms31位點部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物有重復(fù)單元，另一些菌株無重復(fù)單元。對于具有重復(fù)單元的序列，不同菌株間以及同一菌株內(nèi)各重復(fù)單元的序列變異均較大，3個位點存在不完整的重復(fù)單元。根據(jù)8個位點的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，81株Lp1型分離菌株分為19個MLVA型。通過PFGE和SBT方法，81株Lp1型分離菌株分別分為46種PFGE帶型和21種ST型。結(jié)論MLVA方法的分型能力不及PFGE方法，而與SBT方法分型能力相當(dāng)。但是，MLVA方法操作簡單、成本低廉，而且可對培養(yǎng)陰性的標(biāo)本進行分型，因此，該方法適合在基層推廣應(yīng)用。

軍團菌；嗜肺軍團菌；分子分型；MLVA

軍團病主要是由嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila，Lp）感染引起的以肺部感染為主的疾病，其中，嗜肺軍團菌中血清1型菌株（Lp1）引起的病例約占到80%左右［1］。已見報道的軍團病暴發(fā)大多與環(huán)境水的軍團菌污染關(guān)系密切［2］。因此，當(dāng)軍團病暴發(fā)以后快速確定污染的水源，對于控制疾病的蔓延具有非常重要的意義。然而，軍團菌廣泛存在于各種環(huán)境水中［3］，僅靠有無軍團菌污染或簡單的血清分型，不能準(zhǔn)確地判斷環(huán)境菌株和臨床菌株間的相關(guān)性，而分子分型的方法能夠在血清分型的基礎(chǔ)上對菌株進行進一步的分型，其分析結(jié)果能更加準(zhǔn)確地闡明環(huán)境菌株和臨床菌株的關(guān)系。因此，軍團菌菌株的分子分型方法在軍團病暴發(fā)調(diào)查中得到了廣泛的應(yīng)用。

脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和序列分型 （Sequence－Based Typing，SBT）是軍團菌分子分型中常用的方法，這些方法具有重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定、分辨力強等優(yōu)點，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于多起軍團菌病暴發(fā)的調(diào)查中［4－5］。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性分析（Multiple Loci VNTR Analysis，MLVA）在許多病原菌的分型研究中都顯示出良好的分型能力［6－7］，然而，該方法在軍團菌分型中的應(yīng)用很少。本研究采用MLVA分型方法，對我國環(huán)境水中分離的部分Lp1型軍團菌菌株和2株參考菌株進行分子分型的研究，并與PFGE和SBT分型結(jié)果進行了比較，以探討該方法在軍團菌分型中的可應(yīng)用性。

1 材料與方法

1．1 菌株來源 本研究采用的81株Lp1型軍團菌菌株于2005—2008年分離自我國9個省市的環(huán)境水標(biāo)本，其中，64株分離自集中空調(diào)冷卻塔水，17株分離自溫泉水，1株分離自生活用熱水。2株參考菌株為ATCC33152和ATCC33153。

1．2 主要試劑與設(shè)備 Taq DNA聚合酶，d NTPs，Xba I酶購自Ta KaRa生物工程公司；50bp DNA Marker為Fermatas產(chǎn)品；PCR引物由北京華大基因公司合成；DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）為德國QIAGEN公司產(chǎn)品；Asc I酶為美國紐英倫生物技術(shù)有限公司 （New England Biolabs，Ipswich， USA） 產(chǎn) 品。 比 濁 儀 為bio Mérieux DENSIMAT；PCR 擴 增 儀 為 Bio－Rad DNA Engine；脈沖場凝膠電泳儀為Bio－Rad CHEFDRIII system；凝膠成像儀為Bio－Rad Gel Doc XR。1．3 軍團菌DNA制備 復(fù)蘇凍存嗜肺軍團菌菌株，挑取典型菌落傳種于BCYE培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。菌株DNA提取按照試劑盒說明進行，提取的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 MLVA 引物參照文獻［8］，選取其中9個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（Variable Number Tandem Repeat，VNTR）位點，序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：20μL總體積中含1×PCR緩沖液、0．2 mmol／L的d NTP、各0．5μmol／L的上下游引物、1U的Taq酶以及1μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃終末延伸5 min。PCR擴增中使用的Taq酶購自大連Takara公司。電泳條件為：2%的瓊脂糖凝膠，3 V／cm，電泳3 h，在凝膠成像儀中讀取片斷長度。結(jié)果分析：由各位點PCR產(chǎn)物大小，確定串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)數(shù)。PCR產(chǎn)物測序：針對每個位點不同長度的擴增片斷，選取1－2株菌的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序引物與擴增引物相同。重復(fù)檢測：對所有研究菌株再次擴增，并采用已經(jīng)測序的PCR產(chǎn)物作為分子量Marker，重新進行電泳和串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)數(shù)讀取。

1．5 PFGE 操作方法參考文獻［9］。制備膠塊的菌懸液濃度為3．8－4．0個麥?zhǔn)蠁挝?，每個膠塊用40 U Asc I酶37℃消化4 h。沙門菌Braenderup血清型菌株H9812作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，每塊膠用40 U Xba I消化。脈沖場凝膠電泳條件為：電壓梯度6 V／cm，電場夾角120°，電泳時間19 h，脈沖時間6．8－54．2 s。

1．6 SBT 參照文獻［10］。①PCR反應(yīng)體系為：50 μL總體積中含1×PCR緩沖液、0．25 mmol／L的d NTP、各0．2μmol／L的上下游引物、2 U 的Taq酶、0．5 U的高保真酶以及2μL DNA模板。②PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃終末延伸5 min。③PCR產(chǎn)物測序：PCR產(chǎn)物交由TaKaRa公司和北京百泰克公司純化和測序。④ST型的確定和分析：測序結(jié)果遞交 “sequence quality tool”（http：／／www．ewgli．org），以檢查測序質(zhì)量，并獲得等位基因序列號。

1．7 聚類分析 采用Bio Numerics（Version 5．10）軟件 （Applied Maths，Kortrijk，Belgium）對分型結(jié)果進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2．1 9個VNTR位點重復(fù)單元多態(tài)性 2株參考菌株的9個VNTR位點均能擴增出單一條帶的PCR產(chǎn)物，各位點的重復(fù)單元拷貝數(shù)分別為8，8，11，2，4，17，1，1，3 和 8，8，10，2，5，15，4，1，14。81株分離菌株9個VNTR位點的等位基因型別數(shù)分別為6，3，4，2，3，3，2，4和7，其中部分菌株的某些位點無擴增產(chǎn)物或產(chǎn)物為非目的片斷。各位點拷貝數(shù)見表2和圖1。

2．2 不同位點重復(fù)單元的序列 9個VNTR位點中的7個位點PCR產(chǎn)物具有重復(fù)單元；Lpms3位點PCR產(chǎn)物無重復(fù)單元；Lpms31位點部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物有重復(fù)單元，另一些菌株無重復(fù)單元。對無重復(fù)單元的序列進行Blast比對，結(jié)果顯示，Lpms3位點PCR產(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫中軍團菌VNTR位點吻合，而Lpms31位點PCR產(chǎn)物序列與VNTR位點以外的基因吻合。

對于具有重復(fù)單元的序列，不同菌株間以及同一菌株內(nèi)各重復(fù)單元的序列變異均較大，Lpms1－b、Lpms3和Lpms31位點存在不完整的重復(fù)單元。

表1 MLVA引物序列和各位點重復(fù)單元長度Tab．1 Primer sequences and sizes of tandem repeats

表2 81株Lp1型軍團菌菌株MLVA重復(fù)單元拷貝數(shù)Tab．2 VNTR sizes and copy numbers of 81 L．pneumophila isolates

2．3 81株Lp1型軍團菌菌株 MLVA型 根據(jù)Lpms1－b、Lpms3、Lpms13、Lpms17、Lpms19、Lpms33、Lpms34和Lpms35等8個位點的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，對菌株進行分型。2株參考菌株表現(xiàn)為不同的MLVA型，81株Lp1分離菌株分為19個MLVA型，其中，Lp．M11型別的菌株最多（n＝23），在7個省市均有發(fā)現(xiàn)且全部為冷卻塔分離菌株，其次為Lp．M6（n＝13）。另外9種 MLVA型（Lp．M1，Lp．M4，Lp．M8，Lp．M10，Lp．M12，Lp．M13，Lp．M15，Lp．M16和 Lp．M18）也包含兩個以上的菌株，除Lp．M12外，每種型別的菌株僅發(fā)現(xiàn)于同一個省市。3處溫泉水分離的17株菌株分為7種MLVA型，各處型別無交叉；63株冷卻塔分離菌株分為14種MLVA型，其中Lp．M6在溫泉水也有分離，Lp．M8在生活熱水中也有分離。5個分離位點（B4，B5，B6，S3和S8）發(fā)現(xiàn)2種以上MLVA型。所有MLVA型見表3。

2．4 與PFGE和SBT分型結(jié)果比較 81株Lp1型軍團菌菌株分別分為46種PFGE帶型和21種ST型。23株Lp．M11型菌株分為15種PFGE帶型和5種ST型，其他菌株數(shù)較多的MLVA型（除外Lp．M13和Lp．M15）也能被PFGE和／或SBT進一步分型。具有相同PFGE帶型或ST型的菌株也可被分為不同的MLVA型。MLVA和PFGE兩種方法結(jié)合可將81株Lp1型軍團菌菌株分為54種分子型別，MLVA和SBT兩種方法結(jié)合可將這些菌株分為31種分子型別，3種方法的分型結(jié)果見圖2。

表3 81株Lp1型軍團菌菌株的MLVA型Tab．3 MLVA types of 81 L．pneumophila 1 isolates

3 討 論

C．Pourcel［6，11］等對軍團菌 VNTR 分型方法進行了較多的研究，本研究也是采用其挑選的VNTR位點進行分析，其中，Lpms37位點前期試驗部分菌株沒有擴增產(chǎn)物，而且重復(fù)單元太短（7～8 bp），普通的瓊脂糖凝膠無法區(qū)分PCR產(chǎn)物長度，因此未用于本研究。根據(jù)報道［11］，Lpms31位點PCR產(chǎn)物太長（部分超過1 000 bp）且有大量的不完全拷貝，本研究還發(fā)現(xiàn)有些菌株的PCR產(chǎn)物序列與VNTR位點的基因序列不符合，因此該位點的電泳結(jié)果也未納入最終分析中。

MLVA分型方法在許多病原菌的分型研究中都顯示出良好的分型能力［6－7］。本研究中81株Lp1型軍團菌菌株分為19個MLVA型，具有較好的多態(tài)性。鑒于本研究中部分菌株來自同一個分離地點，我國環(huán)境水中Lp1型軍團菌菌株實際的多態(tài)性應(yīng)該更高。通過比較，MLVA方法的分型能力不及PFGE方法，而與SBT方法分型能力相當(dāng)。但是，MLVA方法操作簡單、成本低廉，而且與SBT一樣可對培養(yǎng)陰性的標(biāo)本進行分型，因此，該方法適合在基層推廣應(yīng)用。對于重復(fù)單元較短的位點，PCR產(chǎn)物大小可能難以判定，這種情況下，可如本實驗，對不同長度的PCR擴增片斷進行測序，確定重復(fù)單元的拷貝數(shù)，并采用已經(jīng)測序的PCR產(chǎn)物作為分子量Marker，對后期的PCR產(chǎn)物進行串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)數(shù)讀取。

圖1 81株Lp1型軍團菌菌株9個VNTR位點的多態(tài)性A：每個泳道為單一PCR產(chǎn)物。泳道1－6為Lpms1－b位點PCR產(chǎn)物、泳道7－9為Lpms3位點PCR產(chǎn)物、泳道10－12為 Lpms31位點 PCR產(chǎn)物、泳道13－18為Lpms35位點PCR產(chǎn)物。B：每個泳道為該位點所有長度的PCR產(chǎn)物混合物。泳道1－5依次為Lpms13、Lpms17、Lpms19、Lpms33和Lpms34位點Fig．1 Polymorphisms of 9 VNTR loci in 81 L．pneumophila 1 isolates（A）Single PCR product in each lane．Lanes：1 to 6，Lpms1－b；7 to 9，Lpms3；10 to 12，Lpms31；13 to 18，Lpms35；（B）Mix PCR product in each lane．Lane 1 to 6 was Lpms13，Lpms17，Lpms19，Lpms33 and Lpms34 in turn

Lp．M11型菌株在數(shù)量上具有明顯的優(yōu)勢，而且在不同的省份均可發(fā)現(xiàn)，這一點對于軍團病的暴發(fā)調(diào)查和環(huán)境水質(zhì)的評價都是不利的。而PFGE和SBT可將這些菌株進行進一步的分型，因此，在需要的情況下可以將這兩種方法與MLVA聯(lián)合運用，以更加準(zhǔn)確地進行軍團菌分型和傳染源判斷。另外，從測序結(jié)果可以看出，不同菌株間以及同一菌株內(nèi)各重復(fù)單元的序列變異均較大，因此，也可以結(jié)合重復(fù)單元的序列對菌株進一步分型。

一些研究報道，某些菌株的MLVA分型與地理分布有關(guān)［7，12］。本研究中，同樣發(fā)現(xiàn) MLVA基因型呈現(xiàn)明顯的地理聚集現(xiàn)象，除Lp．M6、Lp．M11和Lp．M12型外，其他型別只在一個省份或分離地點出現(xiàn)，而同一地區(qū)內(nèi)分離的菌株多具有相同的MLVA型。

圖2 81株Lp1型軍團菌菌株的MLVA型聚類分析Fig．2 Cluster analysis of MLVA types of 81 L．pneumophila 1 isolates

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Assessment on the application of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis for Legionella subtyping

ZHU Bing－qing，REN Hong－yu，ZHOU Hai－jian，GUAN Hong，SHAO Zhu－jun

（State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China）

To evaluate the applicability of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis for Legionella subtyping，9 VNTR loci were selected to type 81 Legionella pneumophila serogroup 1 strains isolated from environmental water in China．There were 6，3，4，2，3，3，2，4 and 7 different products amplified from 9 VNTR loci respectively．No specific amplification was obtained from several loci of some strains．Repeated sequences were identified in PCR products of 7 loci．No repeated sequence was found in all sequenced products from locus Lpms3 and in some products from locus Lpms31．The sequences of tandem repeats varied within the same isolate as among isolates．Incomplete tandem repeats were found in 3 loci．Based on the polymorphisms of 8 loci，81 Lp1 strains could be classified into 19 types．Comparatively，these strains could be divided into 46 species and 21 molecular types by PFGE and SBT respectively．So，MLVA was less sensitive for Legionella subtyping．But it was easy and low－cost，and could be used in relatively simply equipped laboratories．

Legionella；Legionella pneumophila；molecular typing；MLVA

R183．3

A

1002－2694（2012）03－0256－05

＊“十一五”科技重大專項（2008ZX10004－007，2008ZX10004－008）

邵祝軍，Email：shaozhujun＠icdc．cn

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道傳染病室，北京 102206

2011－11－14；

2011－12－31