革蘭陰性菌多粘菌素耐藥機制研究進展

杜佳，侯淵博

（1 中國科學院腫瘤與基礎醫(yī)學研究所，中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州；2 浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州）

1 背景介紹

近 年 來，多 重 耐 藥（multidrug-resistant， MDR）和 全 耐 藥（pan-drug-resistant， PDR）肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌愈發(fā)增多，這些細菌往往攜帶碳青霉烯酶，此酶可以使絕大多數(shù)β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物失活，并且這些細菌還攜帶可以水平轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒，進一步加劇了耐藥傳播[1]。針對這些耐藥細菌，目前臨床尚缺乏有效的治療措施，迫使臨床醫(yī)生選擇已摒棄使用的多粘菌素和磷霉素進行治療，但是治療效果都不理想[2]。

體外實驗表明MDR 細菌通常對多粘菌素表現(xiàn)敏感，但是隨著臨床用量的增加，細菌對多粘菌素的耐藥率呈逐年遞增的趨勢。目前用藥指南明確指出磷霉素只適用于治療尿路感染，這樣做的目的是可以降低耐藥率的發(fā)生[3]。由于MDR 細菌對多粘菌素非常敏感，耐藥率極低，因此多粘菌素被認作為最后一道“防線藥物”[4]。本綜述主要針對目前多粘菌素耐藥機制及耐藥變遷做闡述。

2 多粘菌素介紹

多粘菌素是一種具有殺菌活性的陽離子肽類物質(zhì)，最早于1947 年從土壤細菌Paenibacilluspolymyxa 中分離得到。目前用于臨床治療的主要是多粘菌素B 和多粘菌素E，二者在結(jié)構(gòu)上只有一個氨基酸不同，但效果卻明顯不同[5,6]。相比多粘菌素B 更為直接激進的作用效果，多粘菌素E 反而會更溫柔遲緩一點，毒力也較弱，因此也更多的用于臨床治療[7,8]。

多粘菌素的作用位點是革蘭陰性菌的外膜，與脂多糖（LPS）脂質(zhì)A 的磷酸基團親和。具體機制為，脂質(zhì)A 帶負電荷，兩端被二價陽離子Ca2+ 和Mg2+ 包圍，多年菌素帶正電荷可以替換Ca2+ 和Mg2+ 破壞細菌外膜的穩(wěn)定性，滲透性改變、細菌內(nèi)容物流失、細菌死亡[9]。

多粘菌素除了具有良好的殺菌作用外，還具有比較嚴重的副作用，如神經(jīng)毒性和腎毒性。正是因為這些副作用，多粘菌素于1970 年被β 內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物替代。最近幾年由于細菌對這些藥物耐藥率愈發(fā)增高，多粘菌素又重新用于臨床。值得注意的是，多粘菌素除了臨床上使用外，一些國家在養(yǎng)殖業(yè)上存在過度使用多粘菌素的現(xiàn)象[10,11]，這也是導致多粘菌素耐藥率增高的原因之一。

3 耐藥機制

3.1 天然耐藥

由于多粘菌素的作用位點是LPS，所以它的抗菌譜比較窄，其中包括大部分的革蘭陰性菌。革蘭陽性菌和一些厭氧菌外膜中沒有LPS，所以多粘菌素對這些細菌無作用。還有一些細菌如普羅威登絲菌屬、愛德華菌屬、布魯士菌屬、軍團菌屬及摩根摩根菌等均對多粘菌素天然耐藥，原因可能是由于這些細菌基因表達的陽離子產(chǎn)物添加到LPS，導致細菌外膜與多粘菌素親和力下降引起[12]。

3.2 基因表達水平改變引起耐藥

多數(shù)腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及嗜麥芽窄食單胞菌對多粘菌素敏感[13]。這些細菌出現(xiàn)對多粘菌素耐藥跟上述天然耐藥細菌一樣是LPS 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導致。

目前在腸桿菌科細菌中，研究最多的主要為兩種分子結(jié)構(gòu)——pEtN 和L-Are4N[10,14]。耐藥的產(chǎn)生是由于這兩種分子結(jié)構(gòu)添加到LPS 上引起細菌外膜與多粘菌素親和力下降[15]。這兩種分子是由LPS 修飾酶基因pmrC、pmrE 和pmrHFIJKLM 表達控制，這些基因的表達則受控于PmrAB 和PhoPQ 雙組分系統(tǒng)[16-18]。除此之外，mgrB 和crrAB 也參與調(diào)控，MgrB 抑制PhoPQ 的表達，CrrAB 參與調(diào)控PmrAB 表達[19-22]。具體耐藥機制是由于參與調(diào)控這些信號通路中的某些基因發(fā)生突變引起，已知的有pmrA、pmrB、phoP 和phoQ 基因發(fā)生突變、mgrB 基因出現(xiàn)插入或缺失突變及crrB 基因發(fā)生突變。

在肺炎克雷伯菌中，其莢膜多糖可以阻止多粘菌素與外膜相結(jié)合[23,24]。另外一些外排泵（AcrAB 和KpnEF）的存在可以加速多粘菌素的外排，這些都可引起多粘菌素敏感性下降[25,26]。除了PmrA/PmrB 和PhoP/PhoQ TCS 外，銅綠假單胞菌中還存在ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 參與調(diào)控多粘菌素耐藥。在phoQ 突變菌株中如果ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 也發(fā)生基因突變，該菌株會出現(xiàn)高耐藥表型[27]。由此看來，ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs與PhoP/PhoQ TCS 可能存在交叉作用，colR/colS 和cprR/cprS 基因增強了PhoQ 的活性和LPS 結(jié)構(gòu)發(fā)生添加L-Ara4N 改變的能力，進而導致高水平耐藥。這種效應可因colR/colS 和cprR/cprS 基因發(fā)生突變而受抑制。研究還表明ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 還可以調(diào)控其他未知基因表達水平介導L-Ara4N 修飾作用[27]。

3.3 異質(zhì)性耐藥

臨床工作者在檢測大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌多粘菌素藥敏的時候往往會遇到異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在用BMD 方法檢測時出現(xiàn)“跳空”或用紙片擴散法檢測是抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)菌落生長可以說明。當把這些菌落挑選出來繼續(xù)檢測藥敏發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥仍然存在。

圖1 CrrAB 介導多粘菌素耐藥及與PmrAB 和PhoPQ 之間關系[22]

在肺炎克雷伯菌研究中，Aurélie Jayol 等人發(fā)現(xiàn)，在對多粘菌素耐藥菌株用Etest 方法檢測多粘菌素的MIC 時，在抑菌圈當中出現(xiàn)散在的小菌落，作者將這些小菌落進行分純培養(yǎng)后，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)此菌株存在PhoP(D191Y) 氨基酸替換，敲除回補試驗表明此突變介導菌株對多粘菌素耐藥[28]。Ana Silva 等人在研究肺炎克雷伯菌生物膜特性中，通過菌譜分析（Population analysis profile， PAP）方法發(fā)現(xiàn)在生物膜狀態(tài)下檢測到一種菌體較小的菌株，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)此菌株對多粘菌素的耐藥表型比較固定，可能是細菌處在生物膜狀態(tài)下，經(jīng)群體感應系統(tǒng)的調(diào)節(jié)出現(xiàn)了異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[29]。Myung-Jin CHOI 等人研究發(fā)現(xiàn)，與敏感株相比多粘菌素耐藥菌株HV 表型及CPS 表達量都發(fā)生下降，耐藥株的抗血清及生物膜形成能力也都發(fā)生降低。體外競爭試驗也發(fā)現(xiàn)耐藥株的競爭優(yōu)勢下降[30]。

Li 等人在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)，臨床分離的菌株中有90%的菌株對多粘菌素異質(zhì)性耐藥。這些亞群菌株與增加多粘菌素耐藥和再生長有著密切關系[31]。但是，鮑曼不動桿菌對多粘菌素異質(zhì)性耐藥的機制目前還不清楚。Alejandro Beceiro 等人研究發(fā)現(xiàn)，lpx 突變的菌株體外生長能力明顯下降，體外競爭和毒力也比敏感菌株有明顯下降[32]。

在陰溝腸桿菌科（Enterobacter cloacae complex， ECC）研究中發(fā)現(xiàn)，E.cloacae 菌株對多粘菌素耐藥具有一定的種群特異性，深入研究機制后發(fā)現(xiàn)，ECC 中多粘菌素異質(zhì)性耐藥是由于PhoPQ雙組分調(diào)控系統(tǒng)控制arn 操縱子基因表達引起的。與E.coli，S.enterica 和K.pneumoniae 不 同 的 是，ECC 菌 株 中PmrAB 和PhoPQ 之間不存在交叉關系[33]。

3.4 質(zhì)粒介導耐藥

Liu 等人[34]首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導多粘菌素耐藥基因——mcr-1。該基因陽性標本主要來源于動物，人源性標本陽性率要遠低于動物源性標本，可能是跟多粘菌素藥物在畜牧業(yè)的使用量較大有關系。研究還發(fā)現(xiàn)，mcr-1 基因具有較強的傳播性，可以轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌中，且mcr-1 可以與不同的耐藥基因整合于同一個轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上，因此這種質(zhì)粒具有較強的危險性。

自mcr-1 基因首次發(fā)現(xiàn)后，世界范圍內(nèi)（包括歐洲、南亞、非洲和美洲地區(qū)等）出現(xiàn)了大量關于mcr-1 的報道[35-41]，說明mcr-1成為全球性問題是不可避免的。目前mcr-1 基因主要存在于大腸桿菌中，在沙門菌和肺炎克雷伯菌中也有檢出，但報道較少。鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中至今未有報道。Yu 等人首次報道了一例整合在耐碳青霉烯大腸桿菌染色體上的mcr-1 基因，這可能與mcr-1 基因在傳播過程中發(fā)生了衍變有關。雖然mcr-1 基因在2015 年首次報道，但是有研究報道顯示2012 的大腸桿菌中也有檢出mcr-1 基因，根據(jù)目前結(jié)果推測mcr-1 基因的出現(xiàn)有可能會更早。mcr-1 基因在人、食物、水、農(nóng)場養(yǎng)殖動物甚至遷徙的鳥類源性標本中均有檢出[34，40，42]，在多重耐藥菌如產(chǎn)ESBL 和碳青霉烯酶的大腸桿菌中也有報道[43,44]。且這些陽性質(zhì)粒分型種類較多，提示mcr-1 基因的兼容性非常好。2016 年7 月，比利時地區(qū)來源于豬和牛的大腸桿菌中檢出一種新的質(zhì)粒介導多粘菌素耐藥基因mcr-2[45]。該基因在牛來源大腸桿菌中的檢出率要遠高于mcr-1 的檢出率。MCR-1 和MCR-2 具有80.65%的蛋白相似度，同屬于磷酸乙胺醇家族，可介導lipidA 添加磷酸乙胺醇基團引起細菌LPS 與多粘菌素親和力下降[34]。在Liu 等人[34]的研究中，攜有mcr-1 的質(zhì)粒命名為pHNSHP45，是一個大小為64Kb 左右的IncI-like 質(zhì)粒，預測有83 個開放閱讀框架（ORFs），G+C 含量為42.7%。該質(zhì)粒最早在2013 年7 月份的一株來源于養(yǎng)豬場分離的大腸桿菌分離得到。藥敏結(jié)果顯示該大腸桿菌對大多數(shù)的抗菌藥物都耐藥，但是對碳青霉烯類藥物保持敏感[34]。攜帶mcr-2的質(zhì)粒命名為pKP37-BE，是一個大小為35Kb 左右的IncX4 型質(zhì)粒，G+C 含量為41.3%，不攜帶其他耐藥基因。目前為止，已有8種mcr 基因突變體被報道（mcr-1， mcr-2， mcr-3， mcr-4， mcr-5， mcr-6， mcr-7， mcr-8）[36-42]，且攜帶mcr 基因的質(zhì)粒載體種類多變，此現(xiàn)象也加劇了mcr 基因的傳播，由此帶來的傳播危害值得密切關注。

3.5 交叉耐藥

根據(jù)目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些多粘菌素年耐藥的革蘭陰性菌并沒有出現(xiàn)雙組分調(diào)控系統(tǒng)中相應基因突變，也不存在異質(zhì)性耐藥、質(zhì)粒介導耐藥。對于這些菌株耐藥機制是如何產(chǎn)生的，交叉耐藥可能是最好的解釋。有研究表明，醫(yī)用消毒劑（如洗必泰）在臨床消毒過程中廣泛使用，可能引起了細菌多多件菌素的交叉耐藥[46]。洗必泰以種陽離子形式存在，它可以替換細菌外膜磷脂雙層中的二價陽離子（Ca2+ 和Mg2+）導致細菌外膜結(jié)構(gòu)瓦解，細菌內(nèi)容物外泄死亡。

綜上可以看出洗必泰的殺菌機制與多粘菌素相似，都是與細菌的外膜結(jié)合。Matthew E et al 等人[46]研究發(fā)現(xiàn)，通過體外誘導試驗使肺炎克雷伯菌對洗必泰耐藥，這些耐藥菌同時產(chǎn)生了對多粘菌素耐藥。肺炎克雷伯菌對洗必泰的耐藥機制與phoPQ 和smvR 基因突變有關，smvR 基因是Tet 抑制基因，與外排泵基因smvA 相鄰。smvR 基因發(fā)生突變后，smvA 基因的表達量升高。而體外誘導肺炎克雷伯菌對多粘菌素耐藥后，并不會產(chǎn)生對洗必泰耐藥。根據(jù)Matthew E et al 等人研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對多粘菌素耐藥可能與消毒劑的使用有交叉關系，這為臨床預防感染提供一定幫助。

4 結(jié)論與展望

近年來由于新藥的缺乏，臨床較多使用多粘菌素治療MDR 革蘭陰性菌引起的感染以及畜牧業(yè)中多粘菌素的濫用導致了多粘菌素耐藥率的升高。值得警惕的是，質(zhì)粒介導到多粘菌素耐藥的出現(xiàn)加劇了耐藥的傳播。因此，多粘菌素耐藥機制的研究在學術(shù)上受到了較多關注。

正是由于新藥的缺乏，在治療MDR 革蘭陰性菌感染方面，多粘菌素可能還會處于主力地位。目前，一種新型復合制劑藥頭孢他啶/阿維巴坦用于臨床治療。這種復合制劑是一種β 內(nèi)酰胺抗生素和有一種β 內(nèi)酰胺酶抑制劑的組合，這種β 內(nèi)酰胺酶抑制劑只能抑制A 類碳青霉烯酶，對B 類金屬β 內(nèi)酰胺酶無效，因此這種復合制劑并不能廣泛使用。Mcr 抑制劑目前仍處于研究階段，真正運用于臨床還尚需較長時間。因此，有效的感染控制措施（如抗生素管制和耐藥監(jiān)測）是目前應對最近出現(xiàn)的多粘菌素耐藥問題的首要方案。