西洋參組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

劉輝，高文遠(yuǎn)，左北梅，董艷艷，王娟

（1.天津科技大學(xué)，天津 300457；2.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

西洋參PanaxquinquefoliumL.，又稱美國(guó)人參（American ginseng），原產(chǎn)于美國(guó)東部和加拿大，是五加科（Araliaceae）人參屬植物。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津的功能。西洋參的栽培周期較長(zhǎng)，一般要4年時(shí)間，通過(guò)組織培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)西洋參的活性成分，可以節(jié)約土地，縮短培養(yǎng)時(shí)間，是西洋參資源解決的一條替代途徑[1-2]。本文綜述了西洋參組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，為西洋參資源的研究提供參考。

1 西洋參愈傷組織的誘導(dǎo)

用于誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的外植體，可以是不同參齡的根、根髓、莖段、葉片、葉柄、花藥、花蕾、胚及胚培養(yǎng)幼苗的子葉和胚軸等[3]，其中芽胞、種胚、葉柄和根都是較理想的外植體。愈傷組織的誘導(dǎo)率在68.7%～97.7%，最高可達(dá)100%[4]。除了外植體的取材部位，外植體的取材時(shí)期也會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)，5月下旬至6月上旬所取的外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)95%以上，而6月下旬以后所取的外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)率僅30%左右，而且愈傷組織生長(zhǎng)緩慢[5]。西洋參芽胞的脫分化先從表面發(fā)生，以后逐漸向內(nèi)生長(zhǎng)，張美萍等[4]以西洋參根為外植體的實(shí)驗(yàn)表明外植體的脫分化是發(fā)生在導(dǎo)管和篩管部位，由內(nèi)部向外隆起，膨大，最后脹破外皮褥出愈傷組織。

用于西洋參愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基有MS，NB，B5等幾種，其中MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，達(dá)到75.51%。研究發(fā)現(xiàn)，西洋參愈傷組織在MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，鮮重和干重都較大；在B5培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，但有利于愈傷組織中人參皂苷的積累。培養(yǎng)基中成分的改變會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和皂苷合成產(chǎn)生顯著的影響[6]。將 MS基本基質(zhì)中KNO3、CaCl2和MgS04的濃度分別降低至原來(lái)濃度的1／8、1／6和1／4對(duì)西洋參培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，降低KNO3和CaCl2的濃度不利于皂苷合成，但適當(dāng)降低 MgS04的濃度利于皂苷合成。濃度為0.65 mmol·L-1的磷最有利于西洋參細(xì)胞的生長(zhǎng)，而1.25 mmol·L-1的磷為皂苷和多糖合成的最適濃度[7]。范代娣等[8]將 MS培養(yǎng)基中 MgSO4·7H2O含量由370 mg·L-1降低到 92.5 mg·L-1，可使嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)率提高到100%，愈傷組織生長(zhǎng)速度提高1.33倍。

西洋參愈傷組織的誘導(dǎo)須添加生長(zhǎng)素類物質(zhì)，與細(xì)胞分裂素合用可起到促進(jìn)作用。常用的生長(zhǎng)素有 NAA（α-萘乙酸）、IBA（3-吲哚丁酸）、IAA（3-吲哚乙酸）和2，4-D（二氯苯氧乙酸）單獨(dú)使用均可誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，但I(xiàn)BA、NAA和IAA單獨(dú)使用時(shí)，誘導(dǎo)率都不高，而且脫分化時(shí)間較遲。以2，4-D（2～3 mg·L-1）和6-BA0.5 mg·L-1誘導(dǎo)率最高，達(dá)到75.51%～100%。在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，2，4-D起主導(dǎo)作用，附加IBA對(duì)愈傷組織產(chǎn)生無(wú)明顯促進(jìn)作用[6-9]。在 MS培養(yǎng)基中同時(shí)加入2，4-D（2.5 mg·L-1）、KT（0.8 mg·L-1）及 LH（700mg·L-1），對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)同樣具有促進(jìn)作用[10]。

2 西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

由于愈傷組織在固體培養(yǎng)基上增殖較慢，不適于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，而西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)比愈傷組織固體培養(yǎng)生長(zhǎng)速度提高近80%。

西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)必須在有激素的培養(yǎng)液中進(jìn)行。常使用的培養(yǎng)基主要是MS及其改良型，激素以NAA，2，4-D，6-BA最為常用，均能使細(xì)胞正常生長(zhǎng)。其中以2，4-D效果最好，2，4-D與6-BA組合效果更佳。懸浮培養(yǎng)的繼代周期一般為18～20 d，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，狀態(tài)好，細(xì)胞量大。pH變化對(duì)西洋參細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大，pH 6.0時(shí)，最有利于人參皂苷Re和西洋參多糖的合成。接種量為25 g·L-1時(shí)，西洋參細(xì)胞的干重增殖倍數(shù)顯著增加。培養(yǎng)溫度為（24±1）℃，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，顏色淺嫩黃色；生長(zhǎng)量較大，生長(zhǎng)速度快，延遲期短；在20℃和（28±1）℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，尤其是28℃以上時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)基本停止。光照顯著促進(jìn)西洋參細(xì)胞次生代謝物的合成，但對(duì)多糖合成沒(méi)有太大影響[11-12]。

藥用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)在人參和紫草等植物上取得了成功[13-15]。目前實(shí)驗(yàn)室常用的是氣升式發(fā)酵罐，相對(duì)于機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐采用氣升式發(fā)酵罐更適合于植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)[16]。采用40 L的氣升式發(fā)酵罐對(duì)西洋參細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)，考察氣升式反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)過(guò)程中的流變學(xué)特性、傳質(zhì)特性以及流場(chǎng)剪切應(yīng)力變化規(guī)律，為以后的擴(kuò)大培養(yǎng)及發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)提供了有力的理論依據(jù)。通過(guò)兩步培養(yǎng)法，綜合考察蔗糖、MJ（茉莉酸甲酯）和LH（水解乳蛋白）可以使西洋參懸浮細(xì)胞中的皂苷產(chǎn)量比補(bǔ)料培養(yǎng)提高4.03倍，達(dá)到31.52 mg·L-1，為工業(yè)化培養(yǎng)中提高皂苷產(chǎn)量提供了一個(gè)新的思路[17]。

3 西洋參毛狀根與冠癭組織培養(yǎng)

毛狀根（Dairy Roots）是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium Rhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。西洋參的葉很難誘導(dǎo)毛狀根，葉柄則較為容易，尤其是帶部分葉的葉柄生命力強(qiáng)，也更易獲得毛狀根。西洋參毛狀根的建立已有成功的報(bào)道[18]。Archana Mathur等[19]將Ri-TL整合到rolA，rolB和rolC基因轉(zhuǎn)化獲得毛狀根經(jīng)八周培養(yǎng)可增值10倍以上，皂苷產(chǎn)量達(dá)到0.2 g·g-1（干重）。賈冬梅等[20]利用發(fā)根農(nóng)桿菌 A4菌株在西洋參根外植體上直接誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)根，在1／2MS和MS固體培養(yǎng)基上得到西洋參發(fā)根，并在B5液體培養(yǎng)基上建立起發(fā)根離體培養(yǎng)系，利用紫外分光光度法測(cè)得西洋參發(fā)根的總皂苷含量達(dá)3.88%。

冠癭組織是指經(jīng)根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化形成的轉(zhuǎn)基因器官——冠癭瘤（Crown Gall）。高鹽濃度的MS培養(yǎng)基最有利于西洋參冠癭組織的生長(zhǎng)和人參皂苷Re的合成。蔗糖濃度為4%時(shí)，最利于組織的生長(zhǎng)和總皂苷的累積，葡萄糖的加入會(huì)抑制冠癭組織生長(zhǎng)和總皂苷的累積。NH4+用量一定的情況下，MS培養(yǎng)基中添加硝基氮，能夠明顯促進(jìn)總皂苷的累積。冠癭組織最適生長(zhǎng)溫度25℃，總皂苷累積的最適溫度為20℃。pH 5.2～5.6有利于總皂苷的累積，過(guò)高既不利于組織生長(zhǎng)，也不利于皂苷的累積。接種量在2～6（gFW／flask）時(shí)，對(duì)西洋參冠癭組織生長(zhǎng)較為有利；接種量為6（gFW／flask）時(shí)，人參皂苷Rb1含量明顯高于其他[21-23]。

對(duì)西洋參冠癭組織生物轉(zhuǎn)化能力的研究近年來(lái)成了一個(gè)新的熱點(diǎn)。西洋參冠癭組織具有促進(jìn)植物體內(nèi)的芳香族化合物糖基化、羥基化和甲基化反應(yīng)的能力，如丹皮酚經(jīng)西洋參冠癭組織可轉(zhuǎn)化為β-葡萄糖苷、1-（2，4-二甲氧基）-乙酮、β-葡萄糖苷[大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羥基衍生物，而大黃素也可轉(zhuǎn)化為β-葡萄糖苷[大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羥基衍生物[24]。Lin Yang等[25]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明西洋參冠癭組織的糖基化能力要遠(yuǎn)強(qiáng)于煙草細(xì)胞懸浮體系。

毛狀根和冠癭組織培養(yǎng)是近些年才興起的培養(yǎng)系統(tǒng)，所以仍存在很多亟待解決的問(wèn)題。由于西洋參與人參在植物形態(tài)、植物化學(xué)、細(xì)胞生理等方面很相似，因此，西洋參毛狀根的培養(yǎng)可借鑒人參毛狀根培養(yǎng)方面的研究報(bào)道[26-27]。另外離體毛狀根和冠癭組織往往不能合成所需產(chǎn)物，利用毛狀根和冠癭組織共培養(yǎng)、Ti和Ri質(zhì)粒對(duì)植物進(jìn)行雙轉(zhuǎn)化，可以有效解決此類問(wèn)題[28-29]。

4 西洋參組織培養(yǎng)中提高有效成分含量的方法

有效成分含量的提高是藥用植物組織培養(yǎng)的難點(diǎn)，也是必須解決的問(wèn)題。目前已經(jīng)工業(yè)化培養(yǎng)成功的人參組織培養(yǎng)，皂苷含量比較穩(wěn)定[30-31]。在西洋參細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甘露醇，能明顯提高人參皂苷的含量，其含量是未加甘露醇含量的3倍，但滲透壓的提高對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)不利，導(dǎo)致生物量下降，影響人參皂苷產(chǎn)量[32]。而通過(guò)兩步培養(yǎng)法可以較好地處理培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的不利因素，提高人參皂苷的產(chǎn)量[17]。在人參毛狀根的培養(yǎng)中，先把人參毛狀根在附加IBA（即3-吲哚丁酸）0.5mg·L-1的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)72h后，再轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基中，6周后毛狀根中總皂苷含量達(dá)到5.19%，單體皂苷Re和Rg含量之和達(dá)到0.3271%[33]，此方法對(duì)西洋參毛狀根培養(yǎng)有一定的參考價(jià)值。

向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子及前體化合物是提高有效成分含量的常用方法。常用的誘導(dǎo)子有MJ（茉莉酸甲酯）、LH（水解乳蛋白）、SA（水楊酸）和酵母提取物等。實(shí)驗(yàn)表明多種誘導(dǎo)子的聯(lián)合應(yīng)用可以更好地促進(jìn)人參皂苷的積累。把紅花、人參、黑節(jié)草寡糖素添加到培養(yǎng)基中后，可使西洋參懸浮培養(yǎng)中Rg組的皂苷含量提高1.83倍[34]。方綺民等[35]在懸浮培養(yǎng)液中加入葡枝根霉，使西洋參中皂苷含量提2倍，且不減慢細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，皂苷產(chǎn)率高。在西洋參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中添加促進(jìn)皂苷生物合成的3個(gè)前體：乙酸鈉、腳牛兒醇和角鯊烯，均可提高培養(yǎng)物中人參皂苷的含量[36]。此外，乙酸鈉也可以提高植物甾醇含量。3種前體中角鯊烯提高皂苷含量最為有效。

外源性植物激素的加入對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成也會(huì)有一定的作用。常用的外源激素有萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等。2，4-D 2mg·L-1、KT（0.05～0.1 mg·L-1）對(duì)西洋參愈傷組織中總皂苷產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用[3]。2，4-D對(duì)Rb1的影響明顯，而2，4-D 0.5 mg·L-1較為適合Re的形成[37]。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，西洋參的組織培養(yǎng)研究還很不充分，應(yīng)當(dāng)借鑒在人參細(xì)胞培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)和不定根培養(yǎng)方面成功的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)更適于植物組織培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，通過(guò)分子手段明確西洋參次生代謝途徑，篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，通過(guò)培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式的優(yōu)化和誘導(dǎo)子的添加以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量等，最終達(dá)到西洋參組織培養(yǎng)工業(yè)化的目的。