豐肉結(jié)海綿相關(guān)鏈霉菌LS298活性代謝產(chǎn)物研究

崔美子，鞏婷，朱平

隨著從陸生放線菌中分離得到的新的候選藥物數(shù)量的銳減[1]，人們把目光投向了更為廣闊的環(huán)境——海洋。與陸生微生物相比，海洋微生物能夠耐受海洋特有的高鹽、高壓、低氧、低溫、低光照等多種極端的條件，因此形成了獨(dú)特的代謝和生理特性，產(chǎn)生了一系列化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生理功能顯著的次生代謝產(chǎn)物[2]。海洋放線菌作為海洋微生物的一個(gè)重要組成部分，其代謝產(chǎn)物也正日益受到關(guān)注，成為尋找和發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物包括候選藥物的重要來源[3]。

我們對從我國南海水域采集的豐肉結(jié)海綿（Gelliodes carnosa）中分離得到的一株放線菌LS298 進(jìn)行了研究。通過 16S rRNA 分子生物學(xué)方法初步判定菌株 LS298（GenBank 編號(hào) FJ937945）為鏈霉菌屬的放線菌?；钚院Y選發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物顯示了較強(qiáng)的抗菌和體外抗腫瘤活性。通過對該菌株的發(fā)酵粗提物進(jìn)行提取分離，目前已得到12 個(gè)化合物，其中一個(gè)被初步認(rèn)定為該菌株的主要抗菌和抗腫瘤活性成分之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌菌株 LS298 和生物檢定菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）63501 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（改良高氏 1 號(hào)培養(yǎng)基）：可溶性淀粉 20 g/L、KNO31 g/L、NaCl 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO40.01 g/L、天然海水，pH 7.2，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min，冷卻后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基（改良 A1 培養(yǎng)基）：可溶性淀粉10 g/L、胰蛋白胨 2 g/L、酵母提取物 4 g/L、天然海水，pH 7.2，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min，冷卻后備用。

生物檢定培養(yǎng)基：胰蛋白胨 5 g/L、牛肉膏 3 g/L、酵母提取物 1.5 g/L，pH 7.2。上層加 0.8% 瓊脂粉，下層加 1.5% 瓊脂粉。121 ℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min，冷卻后備用。

1.1.3 儀器 核磁共振譜采用美國 Varian 公司的 Mercury-300、Mercury-400、UNITY VNS-600型、瑞士 Bruker 公司的 AVANCE-500 型核磁共振波譜儀測定，四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)；ESI-MS 采用美國 Agilent 公司 1100 LC/MSD Trap SL 型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，EI-MS 采用英國Micromass 公司 VGZAB-2F 型質(zhì)譜儀測定；樣品分析和分離采用美國 Agilent 1200 分析型高效液相色譜儀和日本島津 LC-20A 型半制備高效液相色譜儀；HZQ-Q 恒溫振蕩搖床由哈爾濱東聯(lián)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 色譜填料 色譜柱分別為 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（9.4 mm ×250 mm，5 μm）；Sephadex LH-20 購自美國 GE Healthcare 公司；D101 型大孔樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠；薄層色譜用層析板購自煙臺(tái)化工研究所；柱色譜用硅膠（200 ～ 300 目、60 ～ 100 目）購自青島海洋化工廠。

1.1.5 試劑 常用分析純試劑購自北京化學(xué)試劑廠；色譜純甲醇購自北京宏達(dá)欣宇科技有限公司；瓊脂粉和可溶性淀粉購自北京拜爾迪生物科技有限公司；蛋白胨和酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4均購自北京化工廠；海水采自河北秦皇島海域。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 將 LS298 菌株接種于種子培養(yǎng)基中，于 28 ℃，180 r/min 的搖床上培養(yǎng)3 d，再將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基以 10% 的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 28 ℃，180 r/min 的搖床上培養(yǎng) 14 d。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離 菌種培養(yǎng) 14 d后，收集發(fā)酵產(chǎn)物 140 L，紗布過濾得到上清液和菌絲體。將上清液通過大孔樹脂柱吸附，90% 乙醇洗脫至無色，減壓濃縮洗脫液，得到總浸膏 56.6 g。再將得到的浸膏用甲醇溫浸 12 h，超聲提取 3 次，每次 45 min，合并提取液，減壓蒸干溶劑，得到甲醇部分提取物 20.6 g。將甲醇部分粗提物采用硅膠柱色譜分離，以石油醚:二氯甲烷:甲醇三相體系梯度洗脫，得到 11 個(gè)組分（Fr.1 ～ Fr.11）。經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，Sephadex LH-20 柱色譜和半制備高效液相色譜分離純化，從 Fr.2 得到化合物 5（2.8 mg）；從 Fr.3 得到化合物 1（2.3 mg）、化合物 2（3.1 mg）、化合物 3（1.9 mg）、化合物 4（12.8 mg）、化合物8（4.6 mg）、化合物 9（16.2 mg）和化合物 12（10.8 mg）；從 Fr.4 得到化合物 6（18.9 mg）、化合物 7（7.0 mg）、化合物 10（4.2 mg）、化合物 11（16.0 mg）。

1.2.3 體外抗腫瘤活性的測定 采用 MTT 法測定化合物 1 ～ 12 對人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-8、人肝癌細(xì)胞 Bel-7402、人胃癌細(xì)胞 BGC823、人肺癌細(xì)胞A549 和人卵巢癌細(xì)胞 A2780 5 個(gè)腫瘤細(xì)胞系的抑制活性。收集處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用含10% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基配制成 1 ×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液，于 96 孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔 100 μl（含 1000 個(gè)腫瘤細(xì)胞），置 37 ℃，5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后加藥，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照，受試樣品設(shè) 3 個(gè)濃度（0.1、1、10 μg/ml），每濃度3 個(gè)平行孔，置 37 ℃，5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng) 4 d。棄去培養(yǎng)液，每孔加入 MTT 溶液（0.4 mg/ml，RPMI1640 配制）100 μl，37 ℃ 孵育 4 h。棄上清液，每孔加入 DMSO 150 μl，溶解 Fomazan 顆粒，輕度振蕩后，用 550 型酶標(biāo)儀在檢測波長 570 nm、參考波長 450 nm下測定 OD 值。以溶劑對照處理的腫瘤細(xì)胞為對照組，根據(jù)以下公式計(jì)算藥物抑制率，并計(jì)算 IC50值：

抑制率（%）=[（對照組平均 OD 值 － 給藥組平均 OD 值）/對照組平均 OD 值）]× 100%

1.2.4 抗枯草芽孢桿菌活性的測定 采用濾紙片擴(kuò)散法，用打孔器將濾紙制成直徑 6 mm 的圓片，120 ℃ 滅菌 30 min 備用。將待測樣品用合適溶劑溶解配制成不同濃度的溶液，陽性對照采用對應(yīng)濃度的氨芐青霉素（Amp），陰性對照為溶解樣品所用溶劑。每個(gè)濃度吸取 5 μl 加至濾紙片上，每個(gè)濃度設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，將濾紙片置于超凈臺(tái)內(nèi)揮干。用移液管向平板中加入 15 ml 生物檢定下層培養(yǎng)基，放置使其冷卻凝固，同時(shí)以 3% 的比例將枯草芽孢桿菌的芽胞混懸液加入冷卻至 40 ～ 50 ℃ 生物檢定上層培養(yǎng)基中，然后用移液管吸取 5 ml 生物檢定上層培養(yǎng)基均勻地倒在含生物檢定下層培養(yǎng)基的平板上，制成抗菌活性檢定平板，置于 4 ℃暫時(shí)保存?zhèn)溆?。用無菌鑷子將不同樣品同一濃度的濾紙片放置在含菌平板上，然后將平板倒置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h，至枯草芽胞桿菌均勻地長滿整個(gè)平板后取出，測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1 為白色粉末。ESI-MS m/z：245[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，300 MHz）δ：7.95（1H，d，J = 7.8 Hz，H-6），5.84（1H，m，H-1'），5.64（1H，d，J = 7.8 Hz，H-5），4.13（1H，m，H-2'），4.08（1H，m，H-3'），3.95（1H，m，J = 6.6 Hz，2.7 Hz，H-4'），3.78（1H，dd，J = 2.7 Hz，12.3 Hz，H-5'a），3.67（1H，dd，J = 3.0 Hz，12.3 Hz，H-5'b）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：166.0（C-4），152.3（C-2），142.6（C-6），102.6（C-5），90.7（C-1'），86.2（C-4'），75.6（C-3'），71.1（C-2'），62.1（C-5'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的尿嘧啶核苷基本一致，故鑒定化合物 1 為尿嘧啶核苷（圖 1-1）。

化合物 2 為無色針晶。ESI-MS m/z：251[M+Na]+；1H-NMR（D2O, 300 MHz）δ：7.86（1H，d，J = 8.4 Hz，H-6），6.30（1H，m，H-1'），5.90（1H，d，J = 8.4 Hz，H-5），4.47（1H，m，H-3'），4.06（1H，dd，J = 8.7 Hz，3.6 Hz，H-4'），3.85（1H，dd，J = 3.6 Hz，12.6 Hz，H-5'a），3.76（1H，dd，J = 5.1 Hz，12.6 Hz，H-5'b），2.41（2H，m，H-2'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的 2'-脫氧尿嘧啶核苷基本一致，故鑒定化合物 2 為 2'-脫氧尿嘧啶核苷（圖 1-2）。

圖 1 化合物 1 ～ 12 結(jié)構(gòu)圖Figure 1 The molecular structures of compounds 1 ～ 12

化合物 3 為無色油狀物。ESI-MS m/z：279[M+H]+，301[M+Na]+；1H-NMR（CD3OD，300 MHz）δ：7.66（2H，dd，J = 3.3 Hz，5.4 Hz，H-3，H-6），7.50（2H，dd，J = 3.3 Hz，5.4 Hz，H-4，H-5），4.23（4H，t，J = 6.6 Hz，H-1'，H-1''），1.65（4H，m，H-2'，H-2''），1.39（4H，m，H-3'，H-3''），0.92（6H，t，J = 7.2 Hz，H-4'，H-4''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的鄰苯二甲酸正丁二酯基本一致，故鑒定化合物3 為鄰苯二甲酸正丁二酯（圖 1-3）。

化合物 4 為無色油狀物。ESI-MS m/z：391[M+H]+，413[M+Na]+；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.65（2H，dd，J = 6.0 Hz，3.0 Hz，H-2，H-2'），7.55（2H，dd，J = 6.0 Hz，3.0 Hz，H-3，H-3'），4.15（4H，dq，J = 11.0 Hz，5.3 Hz，H-6，H-6'），1.59 ～ 1.64（2H，m，H-7，H-7'），1.27 ～ 1.41（16H，m，H-8，H-8'，H-9，H-9'，H-10，H-10'，H-12，H-12'），0.84 ～ 0.90 （12H，m，H-11，H-11'，H-13，H-13'）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：169.3（C-4，C-4'），133.6（C-1，C-1'），132.3（C-3，C-3'），129.9（C-2，C-2'），69.1（C-6，C-6'），40.1（C-7，C-7'），31.6（C-8，C-8'），30.1（C-9，C-9'），25.0（C-12，C-12'），24.0（C-10，C-10'），14.4（C-11，C-11'），11.4（C-13，C-13'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯基本一致，故鑒定化合物 4 為鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（圖1-4）。

化合物 5 為白色粉末。ESI-MS m/z：161[M+H]+；1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.40（1H，s，H-2），8.18（1H，m，H-4），8.00（1H，m，H-7），7.98（1H，m，H-6），7.96（1H，s，H-5）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：165.5（3-CONH2），144.6（C-7a），143.8（C-2），142.9（C-4a），139.8（C-3），131.9（C-5），131.2（C-6），129.5（C-4），129.0（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的 3-甲酰胺-吲哚基本一致，故鑒定化合物 5 為 3-甲酰胺-吲哚（圖 1-5）。

化合物 6 為無色針晶。ESI-MS m/z：197[M+H]+，219[M+Na]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.78（1H，s，NH），4.02（1H，m，H-6），3.87（1H，s，H-9），3.50（2H，m，H-3），2.57（1H，m，H-10），2.31（1H，m，H-5a），1.96（2H，m，H-4），1.86（1H，m，H-5b），1.00（3H，d，J =6.9 Hz，H-12），0.84（3H，d，J = 6.9 Hz，H-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的環(huán)（脯氨酸-纈氨酸）基本一致，故鑒定化合物 6 為環(huán)（脯氨酸-纈氨酸）（圖 1-6）。

化合物 7 為白色針狀結(jié)晶。ESI-MS m/z：245[M+H]+，267[M+Na]+；1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.24（3H，m，H-3'，H-4'，H-5'，），7.13（2H，m，H-2'，H-6'），4.14（1H，m，H-9），3.48（1H，m，H-6），3.28（2H，m，H-3），3.13（1H，dd，J = 4.5 Hz，13.5 Hz，H-10a），2.93（1H，dd，J =4.5 Hz，13.5 Hz，H-10b），1.98（1H，m，H-5a），1.85（1H，m，H-5b），1.57（2H，m，H-4）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：171.3（C-7），167.4（C-1），136.7（C-1'），131.3（C-2'），131.3（C-6'），129.6（C-4'），128.5（C-3'），128.5（C-5'），59.8（C-6），59.1（C-9），46.1（C-3），41.0（C-10），29.8（C-5），22.5（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）基本一致，故鑒定化合物 7 為環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）（圖 1-7）。

化合物 8 為無色油狀物。ESI-MS m/z：261[M+H]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.05（2H，d，J = 8.5 Hz，H-2'，H-6'），6.78（2H，d，J = 8.5 Hz，H-3'，H-5'），6.57（1H，s，NH），5.83（1H，s，OH），4.21（1H，dd，J = 2.5 Hz，10.5 Hz，H-9），4.09（1H，t，J = 7.5 Hz，H-6），3.50（2H，m，H-3），3.47（1H，dd，J = 14.5 Hz，2.5 Hz，H-10a），2.76（1H，dd，J = 14.5 Hz，10.5 Hz，H-10b），2.34（1H，m，H-5a），2.05（1H，m，H-5b），2.00（1H，m，H-4a），1.90（1H，m，H-4b）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：169.7（C-7），165.2（C-1），155.6（C-4'），130.3（C-2'），130.3（C-6'），127.0（C-1'），116.1（C-3'），116.1（C-5'），59.1（C-6），56.2（C-9），45.4（C-3），35.9（C-10），28.3（C-5），22.5（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）基本一致，故鑒定化合物 8 為環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）（圖 1-8）。

化合物 9 為無色針晶。ESI-MS m/z：211[M+H]+；1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.92 （1H，s，NH），4.08（1H，m，H-6），3.64（1H，s，H-9），3.54（2H，m，H-3），2.31（1H，m，H-5a），2.15（1H，m，H-5b），2.00（1H，dd，J = 13.5 Hz，4.5 Hz，H-10a），1.92（2H，m，H-4），1.72（1H，m，H-11），1.60（1H，dd，J = 13.5 Hz，4.5 Hz，H-10b），1.06（3H，d，J = 6.9 Hz，H-12），0.91（3H，d，J = 6.9 Hz，H-13）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：169.9（C-7），164.9（C-1），60.4（C-6），58.8（C-9），45.1（C-3），38.2（C-10），28.5（C-5），28.4（C-11），22.4（C-4），19.2（C-13），16.1（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）基本一致，故鑒定化合物 9 為環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）（圖 1-9）。

化合物 10 為紅色粉末。ESI-MS m/z：434[M+H]+；1H-NMR（CD3OCD3，500 MHz）δ：8.23（1H，s，H-15），7.62（1H，s，H-18），7.54（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），7.21（1H，t，J = 7.5 Hz，H-6），7.00（1H，t，J = 7.5 Hz，H-5），6.94（1H，d，J =7.5 Hz，H-7），6.03（1H，brs，H-22），5.32（1H，s，H-8），5.00（2H，m，H-23a,，H-23b），3.68（3H，s，1-OCH3），1.23（6H，m，H-24，H-25）；13C-NMR（CD3OCD3，125 MHz）δ：167.0（C-13），160.8（C-10），148.1（C-7a），144.3（C-22），141.6（C-9），138.0（C-18），134.0（C-20），129.4（C-6），127.3（C-3a），127.3（C-16），126.0（C-4），125.9（C-12），124.5（C-5），113.7（C-23），112.9（C-7），109.1（C-15），108.1（C-8），103.1（C-2），65.5（1-OCH3），54.0（C-3），43.6（C-21），24.3（C-24），24.3（C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的 meleagrin 基本一致，故鑒定化合物 10 為 meleagrin（圖 1-10）。

化合物 11 為白色粉末。FAB-MS m/z：159[M+H]+；1H-NMR（D2O, 400 MHz）δ：4.55（1H，dd，J = 2.4 Hz，4.8 Hz，H-5），4.01（1H，s，H-4），3.45（1H，dt，J = 2.4 Hz，14.4 Hz，H-3'a），3.34（1H，dt，J = 2.4 Hz，14.4 Hz，H-3'b），2.31（3H，s，H-7）；13C-NMR（D2O，100 MHz）δ：177.2（C-8），163.4（C-2），62.7（C-4），62.3（C-5），45.5（C-6），20.8（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道的5-hydroxyectoine 基本一致，故鑒定化合物 11 為5-hydroxyectoine（圖 1-11）。

化合物 12 為淡黃色晶體。HPLC-MS m/z：1101[M+ H]+，1123[M+ Na]+；1H-NMR（DMSO，600 MHz）δ：9.63（1H，s，H-3），9.62（1H，s，H-3），8.83（1H，d，J = 6.6 Hz，Ser-NH），8.65（1H，d，J = 6.6 Hz，Ser-NH），8.19（1H，d，J = 8.4 Hz，H-8），8.17（1H，d，J = 8.4 Hz，H-8），7.98（1H，brd，H-7），7.96（1H，brd，H-7），7.88（1H，m，H-5），7.83（1H，m，H-5），7.80（1H，m，H-6），7.83（1H，m，H-6），6.99（1H，d，J = 6.6 Hz，Ala-NH），6.85（1H，brs，Ala-NH），6.49（1H，d，J = 8.4 Hz，Y-CH），6.14（1H，brd，J = 10.8 Hz，X-CH），5.15（1H，d，J = 9.6 Hz，Val-CHa），5.12（1H，d，J = 9.6 Hz，Val-CHa），4.96（1H，m，Ser-CH），4.95（1H，m，Ala-CH)，4.93（1H，d，J = 8.4 Hz，Z-CH），4.84（1H，m，Ser-CH），4.74（1H，m，Ala-CH），4.71（1H，dd，J = 5.4 Hz，11.4 Hz，Ser-CH2），4.64（1H，dd，J = 5.4 Hz，11.4 Hz，Ser-CH2），3.44（1H，d，J = 15.0 Hz，S-CH-A），3.18（3H，s，Val-N-CH3），3.11（3H，s，Val-N-CH3），3.01（3H，s，Cys-N-CH3），3.00（3H，s，Cys-N-CH3），2.88（1H，dd，J = 10.8 Hz，15.0 Hz，S-CH-B），2.37（1H，m，Val-CHβ），2.31（1H，m，Val-CHβ），2.10（3H，s，S-CH3），1.41（3H，d，J = 6.6 Hz，Ala- CH3），1.38（3H，d，J = 6.6 Hz，Ala-CH3），1.10（3H，d，J = 4.8 Hz，Val-CH3），1.09（3H，d，J = 4.8 Hz，Val-CH3），0.92（3H，d，J = 6.6 Hz，Val-CH3），0.89（3H，d，J =6.6 Hz，Val-CH3）；13C-NMR（DMSO，150 MHz）δ：173.6（Ala C = O），173.4（Ala C = O），171.2（Val C = O），170.9（Val C = O），170.2（Cys X-CH-C= O），168.8（Cys Y-CH-C = O），167.5（C-11），167.3（C-11），164.1（Ser C = O），164.0（Ser C = O），144.2（C-9），144.1（C-9），143.7（C-3），143.6（C-3），142.4（C-10），142.3（C-10），140.2（C-4），140.1（C-4），132.1（C-5），132.0（C-5），131.1（C-6），131.0（C-6），129.7（C-8），129.6（C-8），129.5（C-7），129.3（C-7），65.0（Ser-CH2），64.8（Ser-CH2），62.7（Val-CHa），62.0（Val-CHa），60.0（Y-CH），53.5（Ser-CH），53.5（X-CH），52.4（Ser-CH），51.9（Z-CH），46.5（Ala-CH），46.2（Ala-CH），32.3（Cys-N-CH3），31.5（Val-N-CH3），30.9（Val-N-CH3），29.8（Cys-N- CH3），27.8（Val-CHβ），27.7（Val-CHβ），27.3（S-CH2），20.4（Val-CH3），20.3（Val-CH3），19.1（Val-CH3），18.8（Val-CH3），18.2（Ala-CH3），17.2（Ala-CH3），15.3（S-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17-19]報(bào)道的 echinomycin 基本一致，故鑒定化合物 12 為 echinomycin（圖 1-12）。

2.2 體外抗腫瘤活性篩選

采用 MTT 法測定了化合物 1 ～ 12 對HCT-8、Bel-7402、BGC823、A549 和 A2780 5 個(gè)腫瘤細(xì)胞系的抑制活性。結(jié)果表明，化合物 12 對上述 5 種細(xì)胞均顯示出較強(qiáng)的抑制活性，其 IC50均小于 0.1 × 10-6mol/L（表 1），其他化合物未表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的抑制作用。

表 1 化合物 12 對幾種腫瘤細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compound 12 against several tumor cell lines

2.3 抗菌活性篩選

采用濾紙片擴(kuò)散法測定化合物 1 ～ 12 抑制枯草芽孢桿菌的活性（樣品濃度10 mg/ml），結(jié)果表明，化合物 3、8、9、12 均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，抑菌圈直徑依次為 8、12、13、21 mm（陽性對照藥 Amp 的抑菌圈直徑為 24 mm），其他化合物未表現(xiàn)出抑菌活性（見圖 2）。

圖 2 化合物 1 ～ 12 抗枯草芽胞桿菌活性檢測結(jié)果Figure 2 The antibacterial activity of compounds 1 ～ 12 against Bacillus subtilis

3 討論

從我國南海豐肉結(jié)海綿相關(guān)鏈霉菌 LS298 發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到 12 個(gè)化合物，包括核苷類成分2 個(gè)，鄰苯二甲酸酯衍生物 2 個(gè)，吲哚類成分1 個(gè)，環(huán)二肽類成分 4 個(gè)，生物堿類成分 3 個(gè)。通過文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)化合物 5 系首次從微生物中分離得到，化合物 10 系首次從放線菌中分離得到。對上述 12 個(gè)化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性和抗菌活性篩選，結(jié)果顯示化合物 12（echinomycin）具有很強(qiáng)的體外抗腫瘤活性和抗菌活性，推測該化合物可能為菌株 LS298 的主要活性代謝產(chǎn)物之一。

Echinomycin 最初發(fā)現(xiàn)于鏈霉菌 Streptomyces echinatus（它與 LS298 的 16S rDNA 序列一致性為 95%）的代謝產(chǎn)物，該菌株系從前蘇聯(lián)的土壤中分離得到[20]。Echinomycin 屬于肽類抗生素家族，也有將其歸為喹喔啉類抗生素[21]。Echinomycin 是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的 DNA 雙插入劑，同時(shí)作為首次發(fā)現(xiàn)的喹喔啉類抗生素，自 20 世紀(jì) 90 年代起曾作為一種抗腫瘤藥應(yīng)用于 II 期臨床治療多種癌癥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，echinomycin 對小鼠的白血病細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞均有抑制作用[22]。近兩年的研究發(fā)現(xiàn)，echinomycin 是靶向缺氧誘導(dǎo)因子的一種癌癥治療藥物，能抑制缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生[23]。除了具有抗腫瘤活性，對革蘭陽性菌，厭氧菌以及抗酸菌也均有活性[22]。在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，echinomycin 對甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，M R S A）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）均具有抗菌活性，且作用均比萬古霉素強(qiáng)[24]，同時(shí)對 MSSA 和 MRSA 菌株引起的急性腹腔感染小鼠顯示了良好的保護(hù)作用。另外該化合物對腸球菌亦有很強(qiáng)的抗菌活性，MIC 為 0.01 μmol/L[25]。因此，該化合物很有可能被開發(fā)成為對抗一些耐藥菌的新的治療藥物。文獻(xiàn)[26]報(bào)道，從拉沙里鏈霉菌（Staphylococcus lasaliensis）中分離得到echinomycin 生物合成基因簇，通過合成生物學(xué)方法在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了 echinomycin 的生物合成。在將來有望通過合成生物學(xué)方法或化學(xué)方法對該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造以獲得具有更強(qiáng)生物活性的結(jié)構(gòu)類似物。

目前，針對 LS298 菌株活性代謝產(chǎn)物的研究仍在繼續(xù)，以期發(fā)現(xiàn)除了上述化合物之外的其他活性成分。

志謝化合物波譜數(shù)據(jù)的測定由本所藥物分析室?guī)椭瓿?，化合物體外抗腫瘤活性篩選由本所藥理室陳曉光課題組周琬琪同志幫助完成，本室鄒建華副教授對相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了幫助，在此深表感謝！

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