含組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

劉曉，屈琳，黃昌發(fā)，余馨，羅勤

單鏈抗體（scFv）是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過一條連接肽，如 (GGGGS)4連接而成的小分子抗體（圖 1）。與全抗相比，它因分子小、容易進(jìn)入實(shí)體腫瘤、體內(nèi)清除快、免疫原性低、成像清晰等優(yōu)點(diǎn)成為目前醫(yī)用抗體研究的熱點(diǎn)[1]。另外，單鏈抗體易于實(shí)現(xiàn)基因操作，可采用微生物細(xì)胞規(guī)模生產(chǎn)，因而相對于哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)線，其制造成本低，在制藥工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一是目的蛋白的純化，即如何將重組蛋白從微生物細(xì)胞產(chǎn)生的總蛋白中分離純化出來。使用蛋白標(biāo)簽進(jìn)行親和純化是目前最有效的蛋白分離純化方法。近年來，多種蛋白標(biāo)簽相繼發(fā)明應(yīng)用。其中，組氨酸標(biāo)簽 [(His)6-Tag] 由于其分子量小，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的親和純化。此外，組氨酸標(biāo)簽還可用于蛋白的定性定量檢測，最近還發(fā)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽可用于特定同位素標(biāo)記。因此，組氨酸標(biāo)簽在醫(yī)用蛋白，包括小分子抗體中的應(yīng)用已經(jīng)越來越普遍。本文綜述了含組氨酸標(biāo)簽小分子抗體在生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為組氨酸標(biāo)簽在重組蛋白藥物中的應(yīng)用提供有價值的參考。

圖 1 抗體結(jié)構(gòu)圖

1 組氨酸標(biāo)簽簡介

組氨酸標(biāo)簽一般由連續(xù) 6 個組氨酸組成，即 (His)6，連續(xù) 5 ～ 9 個組氨酸標(biāo)簽也有報道，可直接連接到蛋白N-端或 C-端，產(chǎn)生融合蛋白，一般不影響蛋白的結(jié)構(gòu)及功能。組氨酸標(biāo)簽特定結(jié)合 NTA（氨基三乙酸）金屬離子絡(luò)合物（圖 2），其親合力為 1 μmol/L。Ni2+是常用的金屬離子，其他離子，如 Co2+、Cu2+、Zn2+也可使用。

NTA 可固定到不同的固相載體上，從而產(chǎn)生不同類型的層析柱。固定化金屬親和層析（immobilised metal affinity chromatography，IMAC）是廣泛使用的親和分離純化技術(shù)[2]。該技術(shù)操作簡單、快速，可在天然或變性條件下，一步將目標(biāo)蛋白從總細(xì)胞液中分離出來。許多酶或熒光標(biāo)記的特定抗體和 NTA 衍生物也相繼出現(xiàn)，它們都是檢測組氨酸標(biāo)簽的靈敏試劑。

圖 2 Ni-NTA 與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合示意圖

2 組氨酸標(biāo)簽是特定的同位素標(biāo)記位點(diǎn)

將放射性同位素與特定的抗體進(jìn)行偶聯(lián)，可以產(chǎn)生理想的靶向分子。這樣的靶向分子既可以作為體內(nèi)腫瘤定位“顯影”試劑，也可作為腫瘤治療性分子。然而，如何定點(diǎn)標(biāo)記小分子抗體一直是抗體藥物研發(fā)的焦點(diǎn)。

診斷藥物的標(biāo)記方法應(yīng)該是可在常溫下操作的，具有可重復(fù)性、高效性和特異性，且不影響標(biāo)記蛋白活性。目前廣泛采用的賴氨酸標(biāo)記法，因蛋白質(zhì)本身賴氨酸含量高，易造成標(biāo)記分子嵌入蛋白結(jié)合區(qū)域，從而使蛋白質(zhì)失活。Cai等[3]研究表明，一種 CEA 雙特異抗體用 N-琥珀酰亞胺4-[18F] 氟苯甲酸酯標(biāo)記后，其免疫活性僅為原來的 57%。Tavaré 等[4]發(fā)現(xiàn)采用非特異性的“氨基酸定向標(biāo)記”方法標(biāo)記細(xì)胞死亡 SPECT 顯影試劑 C2A，導(dǎo)致 C2A 不能與靶點(diǎn)結(jié)合，然而采用新的 C-末端組氨酸標(biāo)簽作為標(biāo)記位點(diǎn)，則完整保留了其蛋白質(zhì)功能。

組氨酸標(biāo)記法操作簡便，只需要將同位素衍生物與帶有組氨酸標(biāo)簽的小分子簡單混勻即可，該法穩(wěn)定、高效、特異性好。Tavaré 等[4]首次將組氨酸標(biāo)簽和半胱氨酸殘基聯(lián)合作為重組蛋白的標(biāo)記位點(diǎn)，在 C2AcHd 的 C-端額外加上CKLAAALEHHHHHH 序列。結(jié)果表明常溫下（37 ℃，10 min）同位素化合物三羰基锝 [99mTc(CO)3]+標(biāo)記效率和比放射性均高于僅加入組氨酸標(biāo)簽（C2AcH-A，～ 83%；C2AcH-F，～ 60%） 或僅加入半胱氨酸殘基（C2Ac，～ 15%）。用瞬時薄層色譜（ITLC）測量放射量，C2AcH 濃度在1 μg/μl 以下，其標(biāo)記率通常高于 96%；使用三羰基錸[Re(CO)3]+標(biāo)記的質(zhì)譜結(jié)果表明，即使標(biāo)記物濃度超過蛋白質(zhì)濃度 10 倍情況下，C2AcH 與 [Re(CO)3]+的結(jié)合效率未見增加，也沒有證據(jù)表明其與 C2Ac 結(jié)合。Waibel 等[5]將此方法應(yīng)用于帶有組氨酸的一種醫(yī)用小分子抗體，獲得了高活性的 99 mTc 標(biāo)記分子（90 mCi/mg），而且該標(biāo)記的抗體在體內(nèi)非常穩(wěn)定，其藥代動力學(xué)及體內(nèi)分布均與共價鍵非定點(diǎn)碘標(biāo)記的抗體無區(qū)別。由于這種定點(diǎn)標(biāo)記新技術(shù)可用于標(biāo)記不同的同位素，所以此方法不僅可以標(biāo)記抗體診斷“顯影”試劑，還可用于標(biāo)記治療性抗體[5]。

目前，一些同位素標(biāo)記組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體正應(yīng)用于腫瘤臨床研究[6]。試驗(yàn)表明，這種標(biāo)記的放射自顯影小分子抗體不僅體內(nèi)穩(wěn)定性良好，而且能準(zhǔn)確定位人體腫瘤。另外，此方法也被用于標(biāo)記其他蛋白藥物，進(jìn)行不同時期的臨床研究[7]。

3 組氨酸標(biāo)簽的非免疫原性

由于越來越多帶有組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體進(jìn)入不同時期的臨床研究。人們開始關(guān)心組氨酸標(biāo)簽在人體內(nèi)的安全性。近幾年來，一些研究機(jī)構(gòu)相繼報道了帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白在人體是非免疫原性的，不會影響其在臨床上的應(yīng)用。Kennedy 等[8]將頂膜抗原 1（AMA1）基因使用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，純化得到帶有組氨酸標(biāo)簽的 AMA1 抗原。將抗原對兔子進(jìn)行免疫，產(chǎn)生了高效價的抗 AMA1 抗體。AMA1 疫苗的成人、兒童臨床 I 期試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗具有良好的耐受性，未觀察到疫苗相關(guān)的異乎尋常的、嚴(yán)重的不良反應(yīng)。在臨床 I 期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行了臨床 II 期試驗(yàn)，同樣未觀察到疫苗引起的嚴(yán)重的不良反應(yīng)[9-12]。最近，英國倫敦大學(xué)癌癥研究中心專門對帶有組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體在人體中的免疫原性問題進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。通過重復(fù)注射帶有組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體，并采用高靈敏度的熒光檢測免疫原性反應(yīng)，結(jié)果表明：盡管患者對小分子抗體的其他組分產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但其組氨酸標(biāo)簽未表現(xiàn)出任何免疫原性[13]。該研究證明了含有組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體是安全的，對人體是非免疫原性的。

4 含組氨酸標(biāo)簽小分子抗體的臨床研究

小分子抗體正成為當(dāng)今新藥研發(fā)的趨勢。至 2009 年已有 19 種小分子抗體進(jìn)入臨床研究，包括臨床 III 期研究[14]。其中，大部分小分子抗體帶有組氨酸標(biāo)簽。

帶有組氨酸標(biāo)簽的抗癌胚抗原（CEA）小分子抗體-酶融合蛋白已經(jīng)進(jìn)入癌癥治療的臨床 I 期、II 期試驗(yàn)。帶有6 個組氨酸的單鏈抗體 CIGB-M3（center for genetic engineering and biotechnology M3）通過基因工程手段在大腸桿菌中可溶表達(dá)，能特異地和癌胚抗原 CEA 結(jié)合[15]。臨床I 期結(jié)果表明，17 例結(jié)直腸癌患者接受131I 標(biāo)記的CIGB-M3 注射后，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物反應(yīng)；并且注射后6 個月內(nèi)，患者血清中沒有檢測到抗 CIGB-M3 的抗體[16]。125I 標(biāo)記的 CEA 小分子抗體 MFE-23-his也正用于放射性免疫介導(dǎo)手術(shù)的臨床 I 期試驗(yàn)。34 例結(jié)腸癌患者（17 例原發(fā)性腫瘤、16 例肝轉(zhuǎn)移、1 例復(fù)發(fā)）以及 1 例肝轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者在手術(shù)前 24、48、72 或 96 h 分別接受125I 標(biāo)記的 CEA 小分子抗體注射。結(jié)果顯示125I 標(biāo)記 CEA 抗體 MFE-23-his，在血液中清除快，具有良好的腫瘤定位能力，總體精確度達(dá)到 84%[17]。該產(chǎn)品已經(jīng)成功應(yīng)用于表達(dá)CEA 的乳腺腫瘤和骨髓瘤在人體內(nèi)的顯影[18]。另外，與上皮細(xì)胞生長因子（EpCAM）靶向結(jié)合的小分子抗體VB4-845 已完成膀胱癌治療的臨床 I 期試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明帶有組氨酸標(biāo)簽的 VB4-845 是安全有效的[19]。使用VB4-845 與假單胞菌外毒素 A 融合而成的融合蛋白，對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者每周進(jìn)行瘤內(nèi)注射的 I 期臨床試驗(yàn)也表明 VB4-845 瘤內(nèi)療法是安全可行的[20]，87.5%（臨床I 期試驗(yàn)總共 20 例晚期或者復(fù)發(fā)性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌）的EpCAM 陽性患者對 VB4-845 療法具有療效反應(yīng)。

5 小結(jié)

組氨酸標(biāo)簽是一種多功能標(biāo)簽，正廣泛應(yīng)用于重組蛋白包括小分子抗體的親和純化、定性定量檢測及同位素定點(diǎn)標(biāo)記。臨床試驗(yàn)表明組氨酸標(biāo)簽對人體是非免疫原性的。目前已有越來越多帶有組氨酸標(biāo)簽的小分子抗體進(jìn)入臨床研究。

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