金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、普通變形桿菌和副溶血弧菌多重PCR檢測體系的構建①

劉金華 王蓓蕾 馬路遙 劉 陽 賀 晨 邵麗鈞 王浩天④

(吉林出入境檢驗檢疫局，長春130062)

食品安全一直以來都是我國乃至世界食品衛(wèi)生行業(yè)關注的熱點，食源性致病菌是威脅食品安全的重要隱患。據WTO統(tǒng)計分析，發(fā)達國家每年都有將近一半的人感染食源性疾?。?］，我國缺乏系統(tǒng)的統(tǒng)計，實際情況可能比發(fā)達國家更嚴重。大腸桿菌O157(EHEC O157：H7)、普通變形桿菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌是典型的食源性致病菌。大腸桿菌O157感染劑量低［2］。在美洲、歐洲和亞洲的日本等地均發(fā)生過多起由EHEC O157：H7引起的重大食源性疾病暴發(fā)事件。EHECO157：H7的感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，在世界各國都受到廣泛關注［3］。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，簡稱VP)，通常廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，我國沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報道［4］。此外由病原微生物引起的食源性疾病事件中變形桿菌屬約占11.3%，而普通變形桿菌和奇異變形桿菌是引起食物中毒的主要變形桿菌［5］。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是重要的病原微生物，是最常見的引起院內感染和食物中毒的病原菌，在全球范圍內具有很高的發(fā)病率和病死率［6］。因此，為有效控制上述4種食源性致病菌發(fā)生擴散，實現準確快速的檢測手段是預防控制其傳播的關鍵所在。目前這幾種菌的檢測主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法、免疫學方法、分子生物學技術和傳感器技術等。

其中傳統(tǒng)檢測食源性致病菌的方法是分離細菌，再生化鑒定和血清學鑒定分型，周期4～7天，程序復雜［7，8］，但該方法是目前各種實驗室常用的方法，許多國家標準方法都是基于常規(guī)方法建立的。這些常規(guī)需要耗費較長時間，或需要特殊的儀器設備。而基于分子生物學技術的PCR方法因其簡便、快速的優(yōu)勢，已成為食品安全檢測的一種常規(guī)技術［9，10］。本實驗旨在建立針對上述4種菌的多重PCR初篩體系，并對其進行優(yōu)化，探討其特異性和靈敏性，同時應用于模擬樣品的快速初篩檢測。

1 材料與方法

1.1菌株來源 普通變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris，ATCC33420)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus，ATCC11778)、副溶血性弧菌(Vibiro parahaemolyticus，ATCC17802)購于北京中原公司。單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，ATCC19111)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus， JLC3563)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi，ATCC13311)、腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis，ATCC13076)、志賀氏菌 (ShigellaJLC3215)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，ATCC33291)、大腸桿菌 O157(Escherichia coli，O157 JLC1242)來自吉林出入境檢驗檢疫局微生物實驗室。

1.2試劑和儀器 DNA提取試劑盒Easy PureTMGenomic DNA Extraction KIT、PCR 試劑：2×Easy Taq PCR SuperMix、TaKaRa TaqTMHot start version、100 bp DNA Ladder Marker購自北京全式金生物技術有限公司;脂培養(yǎng)基(Nutrient agar，NA)、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose soya agar，TSA)、血平板、溶菌肉湯(Luria～bertani，LB)、氯化鈉蔗糖平板、氯化鈉結晶紫增菌液、哥倫比亞瓊脂平板、布氏肉湯、革蘭氏陰性菌增菌菌液(Gram negative，GN)購自北京陸橋技術有限責任公司。

Binder恒溫培養(yǎng)箱(德國賓得公司)、離心機(3K30型，德國SigmaSartorius公司)、ProS梯度PCR儀(德國 Eppendorf公司)、PowerPac Universal 164-5070電泳儀(美國伯樂公司)、Alphalmager EC紫外成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)、Milliflex Plus濃縮儀(美國Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1菌株培養(yǎng) 志賀菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、腸炎沙門菌、傷寒沙門菌、蠟樣芽孢桿菌均用NA培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，然后挑取3～4個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱經過37℃培養(yǎng)24小時。金黃色葡萄球菌用TSA血平板37℃過夜培養(yǎng)，取3～4個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時。單核細胞增生李斯特菌用TSA血平板35℃培養(yǎng)24小時，取3～4個菌落接種到 LB液體培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24小時。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養(yǎng)24小時，然后挑取3～4個菌落接種到氯化鈉結晶紫增菌液，37℃增菌8～16小時?？漳c彎曲菌挑取適量的菌種接種于哥倫比亞瓊脂平板，微需氧條件下(O2，5% ，N2，85% ，CO2，10%)42℃培養(yǎng)24～48小時，挑取黑色菌落到布氏肉湯過夜增菌。

1.3.2DNA提取 取1.3.1細菌培養(yǎng)液各4 ml按Easy PureTMGenomic DNA Extraction KIT試劑盒說明書操作提取DNA。用酶標儀測定DNA的濃度，用無菌水將DNA終濃度調整為2 ng/μl，用作后續(xù)PCR反應的模板。

1.3.3引物設計與合成 在GenBank中查出4種細菌的特異性序列，然后進行靶序列的篩選，使用Primer5.0軟件進行引物的設計，并評價引物之間有無二聚體，得到了針對這4種菌株的4對PCR引物。使用BLAST程序對各引物及擴增產物同源性進行比對。引物由上海生物工程有限公司合成。序列見表1。

1.3.4單重PCR擴增 對4種目標菌的核酸提取物進行單獨擴增，反應體系：模板DNA 1 μl(2 ng/μl)，上、下游引物各 1 μl(10 μmol/L)，2 × Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl總體積 25 μl。PCR擴增條件：預變性95℃ 3分鐘，每個循環(huán)條件為 95℃變性 30秒，62℃退火 30秒，72℃延伸30秒，34個循環(huán)，產物末端72℃ 延伸10分鐘。

“新政”是經濟危機的結果，它對國民經濟的干預擴大了政府的權力與責任，但覆蓋范圍仍不夠廣，它的受益者主要是中產階級、農民和那些有組織的具有優(yōu)勢的城市工薪階層中的白人，黑人、印第安人的遭遇仍然很悲慘，他們深受種族歧視、失業(yè)、貧困的折磨。

1.3.5多重PCR體系的建立及退火溫度優(yōu)化

1.3.5.1多重PCR體系的建立 通過正交實驗的方式，首先確定多重PCR的反應體系為10×buffer：5 μl，Taq 酶0.8 μl、dNTP 10.0 μl、上下游引物均為1.2 μl，模板 DNA(2 ng/μl)：各加 3 μl，ddH2O 補足體積為50 μl。多重 PCR擴增條件：預變性 95℃3分鐘，每個循環(huán)條件為95℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，34循環(huán)，72℃延伸10分鐘。

1.3.5.2退火溫度優(yōu)化 采用梯度PCR，退火溫度依次設置為58℃ ～65℃，根據電泳條帶的清晰度及亮度確定出最佳退火溫度。

1.3.6特異性和靈敏度檢測

1.3.6.1特異性檢測 分別取1.3.2提取的10種菌的DNA(2 ng/μl)作模板，按照如下反應體系進行多重 PCR：10 × buffer：5 μl，Taq 酶 0.8 μl、dNTP 10.0 μl、上下游引物均為 1.2 μl，模板 DNA 各加 2 μl，ddH2O補足體積為50 μl。多重 PCR擴增條件：預變性95℃3分鐘，每個循環(huán)條件為95℃變性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，34循環(huán)，72℃延伸10分鐘。

1.3.6.2靈敏度檢測 4種菌經過LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時后，采用平板計數法測定純培養(yǎng)的菌液濃度，用生理鹽水調整各個菌液濃度為108CFU/ml，然后做10倍梯度稀釋。各個濃度的菌液分別取4 ml，按照1.3.2的方法提取DNA，根據優(yōu)化后的多重PCR體系，取同一濃度梯度的4種菌的核酸提取物各3 μl，混合作為模板，按照1.3.5優(yōu)化后的條件進行多重PCR。多重PCR反應能夠檢出的最小DNA量所對應的菌濃度即為該體系的靈敏度。

1.3.7模擬海產品中細菌的檢測 購買市售的新鮮牡蠣、魷魚、黃花魚、梭子蟹、海螺、墨魚。經國標法［11］檢測，大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、普通變形桿菌、葡萄球菌均為陰性。分別各取25 g與250 ml 3%的NaCl溶液混合，勻漿處理。取1.3.6.2稀釋得到的濃度為108CFU/ml的每種菌液2 ml，加入到每種海鮮的4份勻漿液中，混勻作為模擬樣本。取模擬樣本各4 ml，于LB中37℃過夜培養(yǎng)。取每份增菌液各10 ml，按1.3.2提取核酸，進行多重PCR檢測。

2 結果

2.1單重PCR擴增 對所選定的各目標菌株，用編碼變形桿菌ureR基因的引物進行PCR，結果擴增出大小約為522 bp的特異性片段，用編碼金黃色葡萄球菌的nuc基因的引物進行 PCR，擴增出大小約為283 bp的特異性片段，用編碼大腸桿菌O157的hlyA基因的引物進行PCR，擴增出大小約為366 bp的特異性片段，用編碼副溶血弧菌的氨基酸脫氫酶(Amino acid dehydrogenase)基因的引物進行 PCR，擴增出大小約為199 bp的特異性片段。

2.2退火溫度優(yōu)化 用梯度PCR儀依次設定退火溫度為 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，對PCR產物的電泳結果顯示64℃對應的條帶最亮也最清晰。說明64℃為最佳退火溫度。如圖1所示。

2.3特異性檢測 用其他菌的DNA作為模板，然后加入本次研究的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、副溶血弧菌相應的特異性引物。結果表明，只有該4種菌擴增出特異性條帶，其余菌PCR結果均成陰性，如圖2所示。

2.4靈敏度檢測 對菌液進行10倍梯度稀釋，然后進行多重PCR。結果顯示，稀釋后第6條泳帶能夠清晰辨別出4條菌的特異性條帶，所對應的菌落計數為103CFU/ml，即本研究中的四重PCR反應體系的靈敏度，如圖3。

2.5應用多重PCR體系檢測人工染菌海產品 對海產品進行人工染菌，然后用此多重PCR體系進行檢測。結果表明，該多重PCR體系可以成功擴增出4種菌相應的目的基因片段，從而識別出接種的4種菌。如圖4，為牡蠣染菌檢測結果。

表1 多重PCR引物Tab．1 Primers of multiplex PCR

圖1 多重PCR梯度退火溫度電泳圖Fig．1 The optimization of annealing temperature

圖2 多重PCR特異性的檢測Fig．2 The result of multiplex PCR specificity

圖3 多重PCR靈敏度的檢測Fig．3 The result of multiplex PCR sensitivity

圖4 多重PCR檢測牡蠣中的細菌Fig．4 The detection of bacteria randomly determinated in the oysterNote：M.100 bp DNA ladder marker;1.VP，O157，PV;2.VP，SA，O157;3.PV，SA，O157;4.SA，PV，VP;5.PV，SA，O157，VP.

3 討論

自1988年報道 Chamberlain等人［11］首次應用多重PCR技術診斷異基因臍帶血干細胞移植治療假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD)以來，多重PCR作為基因工程的基本技術之一，被廣泛應用于各種遺傳疾病的診斷、基因的缺失、突變和多態(tài)性分析，病原微生物毒力基因的檢測，尤其是各種病原微生物的檢測和鑒定。

多重PCR是在同一個反應體系中加入多對引物同時擴增多段靶序列。多重PCR由于涉及的因素多，引物之間的結合以及引物和底物之間的競爭，使其反應體系比常規(guī)的反應體較常規(guī)PCR更為復雜［12，13］。本實驗采用正交設計探索實驗條件，設計了L9(34)正交實驗，快速準確地找到了最佳實驗條件。PCR試驗的影響因素有退火溫度、循環(huán)數、反應體積等，但最主要的是退火溫度，退火溫度決定PCR特異性與產量。溫度高，特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降;溫度低，產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。趙邦榮［14］、劉志杰［15］等人通過溫度梯度PCR有效、快速的確定出最佳PCR退火溫度。本實驗通過溫度梯度PCR，確定64℃30秒的最佳退火溫度和時間，得到了理想的目標片段。

多重PCR反應產物的特異性除了取決于引物和模板的匹配程度，還要關注一個體系內多對引物之間是否存在序列互補。本實驗利用prime5.0軟件設計引物，又借助BLAST軟件進行序列比對，避免引物之間有同源性，而且每對引物和其他引物的靶序列之間不存在互補序列。在實驗設計中，同一多重PCR體系中加入了6種干擾菌，結果只擴增出目的條帶，沒有非特異性產物。進一步驗證了本實驗的四對引物具有很強的特異性。

本實驗對靈敏度的檢測結果和王虎虎等人［16］的多重PCR靈敏度的檢測結果相近，高于李盛豐等人［17］的多重PCR靈敏度檢測結果?？赡苁潜緦嶒炈玫囊飻U增效率同上述報道不同，此外使用的試劑擴增效果略有差異導致檢測的靈敏性有所不同。除此之外，體系中各組分的比例、反應循環(huán)數均對多重PCR的擴增效果有影響。

對比起常規(guī)的PCR檢測，本研究中一次性加入多種不同菌的引物，一次反應即可擴增出相應菌的基因片段，將這種技術應用于實際致病菌檢驗中，具有高通量的優(yōu)點，大大提高了檢測效率。

雖然多重PCR有很多優(yōu)勢，但由于它的檢測靈敏度高，對食品中一些已經死亡的細菌DNA也能檢測出來，導致結果假陽性。本實驗采用對食品檢測前增菌的方法，用酶標儀監(jiān)測增菌液的OD值(OD值在0.1～3為對數期)，用增菌液來提取DNA。此種方法檢測的都是活的致病菌，而且對于一些不容易直接提取DNA的樣品，例如食品碎屑等，也可以采用這種前增菌的方法。

總之，多重PCR具有較高的靈敏度和特異性，極大縮短了檢測時間，提高了檢測效率和通量，為一種理想的食品中致病菌的快速初篩手段，是國標方法的有力補充，為食源性致病菌快速檢測探索了新的途徑［18］。

1 Hedberg C.Food-related illness and death in the United States［J］.Emerge Infect Dis，1999;5(5)：840-842.

2 聶青和.感染性腹瀉［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：323-339.3 李剛山，王意銀，鄧 波 et al.大腸埃希菌 O157：H7分離鑒定及毒素基因多重 PCR檢測［J］.中國熱帶醫(yī)學，2011;11(12)：1431-1433.

4 劉 陽，孔繁德，徐淑菲et al.副溶血弧菌檢測技術的研究進展［J］. 經濟動物學報，2012;16(1)：49-54.

5 王 鵬，張會彥，馬曉燕et al.環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測變形桿菌屬的研究［J］.食品工業(yè)，2011;10：106-109.

6 李彥媚，李純厚，趙喜紅et al．金黃色葡萄球菌檢測方法的研究進展［J］.安徽農業(yè)科學，2012;40(16)：8927-8931.

7 吳海娟，扈慶華，李慶閣 et al.實時熒光PCR同時檢測金黃色葡萄球菌和大腸桿菌 O157：H7［J］.中國熱帶醫(yī)學，2009;9(5)：814-815.

8 曹際娟，徐君怡，孫哲平et al.乳粉中普通變形桿菌和奇異變形桿菌復合 PCR-DHPLC檢測技術的建立［J］.生物技術通報，2008;S1：420-424.

9 Mukhopadhyay A，Mukhopadhyay U K.Novel multiplex PCR approaches for the simultaneous detection of human pathogens：Escherichia coli O157：H7 and Listeria monocytogenes［J］.J Micro Meth，2007;68(1)：193-200.

10 Wang R F，Cao W W，Johnson M G.16S rRNA based probes and polymerase chain reaction method to detect Listeria monocytogenes cells added to foods［J］.Applied and Environmental Microbiology，1992;58(9)：2827-2831.

11 Chamberlain J S，Gibbs R A，Rattier J E et al．Multiplex PC for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy［M］.San Diego：Academic Press，1990：272-281.

12 Sudhir T，John L M，Maryanne D.Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Staphylococcus aureus in dairy products［J］.J Food Prot，2001;64(5)：664-668.

13 Sandery M，Stinear T，Kaucner C.Dectection of pathogenic Yersinia enterocolitica in environmental waters by PCR［J］.J Appl Bacteriol，1996;80：327-332.

14 趙邦榮，張香改，齊娜娜et al．優(yōu)化多重PCR擴增效果的實驗研究［J］.河北醫(yī)藥，2011;33(11)：1674-1675.

15 劉志杰，李如舉，曾智勇et al.多重PCR反應的影響因素及其優(yōu)化［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011;7(1)：26-28.

16 王虎虎，徐幸蓮.冰鮮雞肉中致病菌三重PCR檢測方法的建立［J］.中國農業(yè)科學，2010;43(17)：3608-3615.

17 李盛豐，趙 姣，鐘名華et al.單增李斯特菌不同PCR快速檢測方法比較［J］.中國公共衛(wèi)生，2008;24(8)：1021-1023.

18 楊 軍，張 馳，劉新梅et al.多重PCR法對乳制品中3種致病菌的同時快速檢測［J］.中國乳品工業(yè)，2010;38(4)：50-53.