柴胡疏肝散對阿爾茨海默病大＊鼠海馬CA1區(qū)超微結構的影響

趙唯賢，李高申，薛紅莉，黃顯峰，裴 瑞，李寧寧，王 黎

(1.河南職工醫(yī)學院，鄭州 451191;2.黃河科技學院，鄭州 450006)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseas，AD)即老年性癡呆，是一種以進行性認知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口的老齡化，帶來了AD患病率的上升，對社會和家庭造成了沉重的負擔，因此研究高效低毒的藥物防治AD，成為醫(yī)學科研人員的一項艱巨任務。本課題通過觀察柴胡疏肝散對大鼠海馬CA1區(qū)超微結構的影響，初步探討疏肝理氣方劑在AD治療中的意義，以期為篩選有效抗AD中藥提供新的探索方向。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD雄性健康大鼠(鼠齡5～6個月)48只，體重300g±20g，由河南省實驗動物中心提供(許可證號SCXK(豫)2010-0002)。

1.2 藥物

1.2.1 制備 每日7∶00將柴胡疏肝散和腦力寶2組處方各稱取120g、90g分放入2只1000 mL瓷杯中，各加500 mL、400 mL純凈水浸泡30 min，放于煤氣爐上加蓋旺火加熱至水沸，改微火煎煮30 min，煎后的藥液過濾倒入另2只凈瓷杯中;重將煎后的藥物分別加水400 mL、300 mL，再次加蓋旺火煮沸，微火煎煮20 min，過濾倒出與第一次煎藥液混合，加熱濃縮藥液至規(guī)定濃度，分裝放至常溫備用。

1.2.2 組成及配比 柴胡疏肝散組成:柴胡、枳殼、白芍、陳皮、香附、川芎、甘草，各藥間質量比2∶1.7∶1.7∶2∶1.7∶1.7∶1，柴胡疏肝散低、高劑量濃度分別為1.2 g·mL－1;腦力寶組成:遠志、熟地、五味子、地骨皮、菟絲子、茯苓、石菖蒲、川芎，各藥間質量等比，濃度為2 g·mL－1，均由我院科研科提供。

1.3 試劑儀器

D-半乳糖(D-gal，國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20110318)，Aβ1～42(Sigma公司，A-1010)，2H-藍星B型腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司生產(chǎn))。超薄切片機(型號LKBV)、透射電鏡(日本電子，JEM-1400)。

2 方法

2.1 分組

將大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白組(A組)、生理鹽水組(B組)、模型組(C組)、疏肝低劑量組(D組)、疏肝高劑量組(E組)、補腎組(F組)共6組，每組8只。大鼠4只/籠，飼養(yǎng)于清潔級動物房，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00～18∶00)，室內溫度控制在22℃～24℃，相對濕度保持在30%～40%，自由飲食飲水。

2.2 模型制作

采用D-gal腹腔注射(ip)和Aβ雙側海馬注射聯(lián)合造模[1]。(1)用生理鹽水將D-gal稀釋成10 g·L－1溶液，自造模第1天始每天上午9∶00～10∶00，對C、D、E、F各組大鼠ip1輪次，100 mg·kg－1;B組ip等體積的生理鹽水，各組共計ip42 d;(2)用無菌生理鹽水事先將Aβ1～42稀釋成10 g·L－1，在37℃溫箱中孵育7 d，使其變成為凝聚態(tài)的Aβ。自D-gal造模結束的次日，大鼠經(jīng)6%水合氯醛(0.6 g·kg－1)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，選擇雙側海馬CA1區(qū)作為注射點，前囟向后3 mm，中線旁開2.2 mm處，分離骨膜，用牙科鉆鉆開顱骨暴露硬腦膜，微量注射器垂直進針2.8 mm，將Aβ1～42溶液1μL緩慢注入，留針5 min保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，用滅菌醫(yī)用骨蠟填補骨孔，縫合切口，碘伏消毒，青霉素鈉注射每只8萬U預防感染，每日1次，連用3 d，常規(guī)飼養(yǎng);B組海馬注射等體積滅菌生理鹽水，方法同上。

2.3 藥物干預與劑量

A組、C組不進行藥物干預，B組選用生理鹽水10 mL·kg－1，D組、E組分別選用低、高劑量的柴胡疏肝散10，20 g·kg－1(均為10 mL·kg－1)，F(xiàn)組選用腦力寶20 g·kg－1(10 mL·kg－1)，于Aβ造模后的第9天，每天上午9∶00各灌胃(ig)1輪次，連續(xù)進行28 d。

2.4 水迷宮行為學檢測

各組分別自Aβ造模的第5天(ig干預前)和第37天(ig干預結束后的次日)各進行水迷宮行為學檢測1輪(每天1次，連續(xù)3 d)，實驗在每天上午9∶00進行。方法:將大鼠自第Ⅰ～Ⅳ4個象限放入，分別記錄尋找安全平臺的時間，取各組大鼠各象限連續(xù)3 d測得時間的平均值進行統(tǒng)計分析。

2.5 取材及觀察

在ig干預結束后的第4天，每組隨機選取3只大鼠6%水合氯醛行腹腔麻醉(0.6 g·kg－1)，打開胸腔，經(jīng)心尖部灌注預冷的生理鹽水400 ml，20 min左右灌流完畢，將灌注液改用4%多聚甲醛400 ml，灌注時間1.5 h內。斷頭、組織鉗打開顱頂，剪開腦硬膜取出海馬，4%戊二醛固定2 h以上，4℃保存，常規(guī)制備，超薄切片機，Leica EMUC-7超薄切片，透射電鏡觀察CA1區(qū)超微結構。

3 結果

3.1 水迷宮成績

表1顯示，①僅造模手術對大鼠智力影響較小，灌胃刺激也不會給大鼠的記憶功能造成影響;②ig給藥前經(jīng)Aβ造模的C、D、E、F各組與空白組比較差異明顯(P＜0.05)，提示本次造模成功;③ig后E組和F組與同組ig前及與同期的模型組比較，均明顯縮短了迷宮尋找平臺時間(P＜0.01)，ig后D組與ig前及同期的模型組比較，迷宮尋找平臺時間變化不甚明顯。

表1 各組大鼠水迷宮尋找平臺時間的比較

表1 各組大鼠水迷宮尋找平臺時間的比較

注:與空白組比較:1)P＜0.01;與灌胃前及與同期模型組比較:2)P＜0.01;與疏肝低劑量組比較:3)P＜0.01(表3同)

組別 造模第5天(給藥前)造模第37天(給藥31 d后)空 白 組A 11.06±2.30 9.70±2.89生理鹽水組B 11.44±2.56 10.47±2.84模 型 組C 17.31±3.681) 17.41±2.931)疏肝低劑量組D 16.93±3.851) 14.52±2.81疏肝高劑量組E 17.34±3.351) 12.78±2.541，2)補 腎 組F 17.79±2.251) 14.11±2.661，2)

3.2 透射電鏡

空白和生理鹽水組，電鏡下可見海馬神經(jīng)突觸前后膜均一，厚度適中，突觸前膜內的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態(tài)正常，線粒體膜、脊完整，內嵴清晰可見，基質均勻(圖1、2)。模型組電鏡下神經(jīng)細胞形態(tài)破壞，結構紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊(圖3)。疏肝低劑量組神經(jīng)元結構基本正常，突觸前膜內突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴較清晰(圖4)。疏肝高劑量組神經(jīng)元結構正常，突觸前膜內突觸小泡、突觸間隙清晰;線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見(圖5)。補腎組神經(jīng)元結構正常，突觸膜增厚，突觸間隙清晰，突觸小泡數(shù)量基本正常，線粒體膜基本完整，線粒體嵴較清晰(圖6)。

圖1 空白組(30000×)

圖2 生理鹽水組(30000×)

圖3 模型組(30000×)

圖4 疏肝1組(30000×)

圖5 疏肝2組(50000×)

圖6 補腎組(30000×)

4 討論

AD患者的主要病理學特征是在腦中形成神經(jīng)原纖維纏結和大量的老年斑以及彌漫性腦萎縮。由于神經(jīng)原纖維纏結的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau，而老年斑的主要成分是β淀粉樣多肽(Aβ)，因此，國外對AD研究的主流方向主要集中在tau和Aβ兩個方面[1]。

線粒體形態(tài)結構和功能的改變是導致AD能量代謝障礙的重要因素和關鍵環(huán)節(jié)，線粒體損傷使Aβ的產(chǎn)生增加，又進一步對線粒體產(chǎn)生損傷[2]，從而使神經(jīng)元退行性變化不斷加重。這可能是導致AD臨床癥狀不斷惡化的原因之一，保護或改善線粒體的結構和功能，將有利于AD癥狀的改善和恢復。

中醫(yī)認為，肝主藏魂，魂是陽之精、氣之靈，魂與神有密切的聯(lián)系，對心理活動會產(chǎn)生較大影響。肝又主謀慮、主持思慮等思維活動。清·陳士鐸指出:癡呆“大約其始也，起于肝氣之郁?！币虼?，理論上支持疏肝理氣法在改善記憶、認知能力障礙上的治療作用，部分疏肝方劑的實驗研究[3-5]也顯示了在調節(jié)記憶、認知方面的作用。藥理研究表明，柴胡能改善腦細胞代謝和腦循環(huán)，延緩衰老引起的活性氧自由基的反應速度，使衰老引起的神經(jīng)功能減退得到恢復[6]。白芍總苷能改善東莨菪堿誘發(fā)的小鼠空間識別障礙，對小鼠學習記憶獲得不良有改善作用。當歸可改善癡呆模型大鼠腦耗氧量和腦血流量，對腦缺血引起的空間認知障礙有改善作用;并能增加絕經(jīng)大鼠腦內海馬區(qū)的煙堿性乙酰膽堿受體數(shù)目，提高膽堿乙?；D移酶的活性。茯苓含有增強脂質代謝及各種酶的輔酶物質，長期服用可使老齡大鼠內在性膽堿和乙酰輔酶A的含量增加，有抑制抗膽堿的作用[7]。臨床研究也顯示，以疏肝解郁為主治療老年期癡呆病，除有助于改善患者的記憶力減退等癥狀外，還可顯著改善其情緒抑郁、反應遲鈍的狀態(tài)，這對于減輕進一步的智能損害、防止病情加重具有重要的臨床意義[8]。

本實驗提示，經(jīng)柴胡疏肝散干預后的大鼠神經(jīng)元結構恢復較好，突觸前膜內突觸小泡清晰，突觸間隙清晰，線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見。對比模型組電鏡下神經(jīng)細胞形態(tài)破壞明顯，結構紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少，游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊，解釋了變性突觸前膜和突觸后膜模糊不清，突觸間隙消失，直接導致神經(jīng)信號傳導障礙，使學習記憶能力下降。同時，柴胡疏肝散大劑量組經(jīng)灌胃干預后，大鼠尋找平臺的時間較灌胃前及同期模型組比較顯著縮短(P＜0.01)，其對大鼠記憶能力的提高不低于補腎組。印證了疏肝理氣方藥對記憶、認知障礙的調節(jié)作用，充分顯示了以疏肝理氣立方在阿爾茨海默病治療中的意義。比較而言，柴胡疏肝散高劑量組較低劑量組作用優(yōu)勢明顯。

AD原因是復雜且漸進的，應從多方位、多靶點對本病從多個環(huán)節(jié)進行研究，期待有更多的實驗研究為臨床用藥提供突破性的依據(jù)。

[1]Kosuga S，Tashiro E，Kajioka T.GSK-3beta directly phosphorylates and activates MARK2/PAR-1.[J].J Biol Chem，2005，280(52):42715-42722.

[2]張忠，薛衛(wèi)國，葛桂玲，等.益智湯對阿爾茨海默病轉基因小鼠海馬超微結構的影響[J].中國老年學雜志，2010，30(5):650-652.

[3]吳紅彥，王虎.逍遙散及其拆方對老年性癡呆模型小鼠學習記憶能力及抗氧化能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15(10):102.

[4]瞿禮萍，曾南，梁珂，等.逍遙散對慢性溫和應激模型小鼠行為學及空間學習記憶能力的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23(5):18.

[5]李維，孔烈，李峰.四逆散對運動性疲勞大鼠海馬突觸素的調節(jié)作用[J].中國康復理論與實踐，2009，15(8):739.

[6]杉木晃.柴胡桂枝湯及其加味方治療老齡患者情緒異常的效果[J].國外醫(yī)學·中醫(yī)中藥分冊，1988，10(3):191

[7]朱振鐸.霍青.薛一濤.疏肝解郁滋腎養(yǎng)心法治療老年性癡呆34例臨床研究[J].山東中醫(yī)藥大學學報，1998，22(5):348.

[8]張慶祥，于梅，李連濤.疏肝解郁治療老年期癡呆病的臨床研究[J].山東中醫(yī)雜志，2006，25(10):661-663.