蛋白質(zhì)組學在顳葉癲癇海馬組織中的研究進展

尹小花， 解文菁， 尹洪濤綜述， 孟紅梅審校

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是最常見的癲癇類型，大約占40%，且很大一部分為藥物難治性癲癇，有統(tǒng)計表明難治性癲癇中70%為TLE，故是目前研究的熱點。海馬硬化是TLE的特征性病理改變，包括海馬神經(jīng)元丟失和異常苔蘚纖維出芽，常常繼發(fā)于最初的顱腦損傷，包括腦外傷、腦卒中、腦腫瘤、腦膜炎和腦炎、兒童時期的熱性驚厥以及癲癇持續(xù)狀態(tài)等，也有一部分病因不明。大量研究表明TLE的形成過程實際上是海馬可塑性神經(jīng)網(wǎng)絡重建的過程，然而亦有人認為海馬的病理改變是反復癇性發(fā)作的結(jié)果。隨著后基因時代的到來，國內(nèi)外許多學者運用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)，通過比較癲癇患者或動物模型組與對照組的腦組織(大腦皮層、海馬)、體液(CSF)或亞細胞結(jié)構(gòu)(線粒體)的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了許多可能與癲癇相關(guān)的蛋白質(zhì)，這為進一步闡明癲癇的發(fā)病機制提供了線索，為新型抗癲癇藥物的研發(fā)提供了分子靶點，并有利于耐藥機制的研究，目前在TLE、難治性癲癇、失神發(fā)作中已經(jīng)取得了一定成果?，F(xiàn)將蛋白質(zhì)組學在TLE海馬組織中的研究進展綜述如下。

1 蛋白質(zhì)組學概述

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念最早是由澳大利亞學者Wilkins和 Williams［1］提出，指的是一個基因組(genome)表達的全部蛋白質(zhì)(protein)或一種細胞、組織、體液、生物體在特定時空上表達的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，闡明蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，以及在整體水平上研究蛋白質(zhì)組成與調(diào)控的活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學研究主要依賴4大技術(shù):蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)相互作用分析及生物信息學。

任何一種疾病在表現(xiàn)出可察覺的癥狀之前，就已經(jīng)有某些蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、表達數(shù)量、修飾方式與相互作用方面發(fā)生了變化。臨床上我們通過比較生理與病理狀態(tài)下細胞、體液或組織的差異蛋白質(zhì)，即比較蛋白質(zhì)組學，可以發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)的特異蛋白，進而為闡明疾病的病因與發(fā)病機制提供線索，為疾病的診斷與判斷預后提供生物學指標，為疾病防治藥物的研發(fā)和篩選提供分子靶點。目前比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)廣泛應用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)、脫髓鞘疾病(多發(fā)性硬化、格林-巴利綜合征)、腦血管病和癲癇等，并取得了一定進展。

2 海馬蛋白質(zhì)組學研究概況

功能上，海馬是邊緣系統(tǒng)的一部分，與學習、記憶、情感、應激和老化等有關(guān)，是目前多種疾病如阿爾茨海默病、精神分裂癥、抑郁癥、唐氏綜合癥和癲癇等的研究焦點。人類、大鼠和小鼠的海馬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分別于2004年［2］、2005年［3］和2006年［4］建立，促進了這些疾病的海馬蛋白質(zhì)組學研究。

結(jié)構(gòu)上，海馬分為CA1～CA4和齒狀回(DG)5個亞區(qū)，各亞區(qū)的結(jié)構(gòu)、功能不同，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的易損性也不同。另外，在海馬內(nèi)存在一條三級興奮性突觸環(huán)路，即內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元經(jīng)穿通纖維投射至齒狀回顆粒細胞、進而經(jīng)苔狀纖維投射至CA3區(qū)錐體細胞、再經(jīng)Schaffer側(cè)支投射至CA1區(qū)錐體細胞，然而海馬可能還存在其他信息處理環(huán)路。因此，對海馬各亞區(qū)的蛋白質(zhì)組學研究具有更重要的意義。Focking等［5］比較了正常海馬各亞區(qū)的蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn) CA2/3與CA4、DG、CA1之間分別有74、66、55 個差異蛋白，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白在CA2/3區(qū)表達顯著上調(diào)，表明這一區(qū)域星形細胞的數(shù)量增多或體積增大。這一發(fā)現(xiàn)有助于我們理解海馬環(huán)路內(nèi)不同細胞的活動水平，其中星形膠質(zhì)細胞的功能可能與氧化磷酸化和代謝活動有關(guān)。

3 TLE的海馬蛋白質(zhì)組學研究

3.1 研究對象的來源 TLE的研究對象包括:(1)患者:主要是內(nèi)側(cè)顳葉(海馬)硬化的手術(shù)切除標本，盡管有助于尋找人的癲癇相關(guān)蛋白。但缺點是一方面由于經(jīng)濟原因及手術(shù)創(chuàng)傷大，標本來源受限;另一方面無法觀察差異蛋白的早期及動態(tài)變化過程。(2)動物模型:目前主要有兩種類型的TLE模型，第一種是應用興奮毒性物質(zhì)(海人藻酸、匹魯卡品等)誘導急性癲癇發(fā)作，然后發(fā)展成自發(fā)性癲癇狀態(tài);第二種是電刺激誘發(fā)慢性復發(fā)性癲癇。這些模型在癥狀學上表現(xiàn)為自發(fā)抽搐，證實海馬、杏仁核和其它邊緣結(jié)構(gòu)在癲癇發(fā)病中占有中心地位;其病理上特異的海馬損傷與TLE的海馬硬化相似;另外這些動物模型對大部分抗癲癇藥耐受，符合TLE的臨床特點，因此為研究TLE提供了良好的實驗基礎，然而盡管如此仍無法準確模擬人的病理生理狀態(tài)。

3.2 TLE發(fā)病機制、海馬病理改變與蛋白質(zhì)組學的相關(guān)性研究 TLE分為內(nèi)側(cè)顳葉癲癇和外側(cè)顳葉癲癇，其中內(nèi)側(cè)顳葉癲癇大部分屬于藥物難治性癲癇，其特征性的病理特點是海馬細胞結(jié)構(gòu)異常，即海馬硬化。這部分患者往往外科手術(shù)治療有效，手術(shù)后能夠控制大約80%～90%的癇性發(fā)作。然而海馬硬化是內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的原因還是結(jié)果目前仍存在很大爭議，通過研究TLE海馬的蛋白質(zhì)組學變化，有助于闡明TLE的分子發(fā)病機制和病理形成機制。

Yang等通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者海馬的蛋白質(zhì)組學變化，發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白［6］、載脂蛋白A-I［7］、細胞內(nèi)酰基輔酶A硫酯水解酶［8］和腦衰蛋白反應介導蛋白-2［9］表達異常，這些蛋白改變有助于闡明內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的分子發(fā)病機制。Jiang等［10］利用雙向凝膠電泳及基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間技術(shù)，研究耐藥性癲癇大鼠海馬的線粒體蛋白質(zhì)組學變化，結(jié)果鑒定出5種蛋白升高和14種蛋白降低，其中升高的電壓依賴性陰離子通道1和降低的電壓依賴性陰離子通道2可使線粒體ATP的生成減少和運輸障礙，最終導致能量衰竭和細胞凋亡，這可能與難治性癲癇的發(fā)病機制有關(guān)。

驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)與繼發(fā)的海馬損傷和內(nèi)側(cè)顳葉硬化有關(guān)。氯化鋰-匹魯卡品和海人酸誘導的TLE大鼠模型，經(jīng)過急性癲癇持續(xù)狀態(tài)、靜止期、慢性自發(fā)性發(fā)作期3個典型的發(fā)病過程，可用來研究海馬損傷的分子和病理形成機制。Greene等［11］分析了匹魯卡品TLE大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后早期的海馬蛋白質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-27、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白-2、細胞骨架蛋白和二氫蝶呤還原酶表達上調(diào)，這些蛋白可能與癲癇的病理機制、神經(jīng)保護及神經(jīng)元反應有關(guān)，因此通過調(diào)節(jié)這些蛋白表達可以抑制海馬損傷及繼發(fā)的癲癇形成。

海馬損傷與興奮性毒性有關(guān)，有證據(jù)表明氧化應激參與興奮性毒性損傷，然而具體的分子機制尚不清楚。Furukawa等［12］通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究海人酸癲癇大鼠海馬的氧化損傷蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-4、纈酪肽包含蛋白、線粒體內(nèi)膜蛋白、α-互聯(lián)蛋白和絡氨酸3-單氧酶羥基化，因羥基化是蛋白質(zhì)氧化的表現(xiàn)形式，故這些蛋白受到氧化損傷，推測可能與海人酸興奮性毒性導致的海馬神經(jīng)元死亡有關(guān)，這些蛋白點可作為癲癇治療的潛在靶點來防治癲癇相關(guān)性神經(jīng)元死亡。

內(nèi)側(cè)顳葉硬化的病理特點之一是海馬齒狀回反應性膠質(zhì)細胞增生和顆粒細胞軸突發(fā)芽，但其具體的分子機制尚不清楚。Li等［13］利用雙向凝膠電泳和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜研究普魯卡因TLE大鼠齒狀回的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24個差異表達蛋白，其中包括9個磷酸化蛋白。這些蛋白在細胞結(jié)構(gòu)形成及維持、突觸活動、能量代謝、細胞應激等方面發(fā)揮重要作用，推測可能與TLE海馬齒狀回的病理改變有關(guān)。

通過TLE海馬改變推測眾多基因與信號轉(zhuǎn)導參與其發(fā)病機制，然而無法通過患者腦組織研究癲癇早期階段的基因變化，為了研究TLE的動態(tài)發(fā)展的分子機制，Liu［14］等通過建立匹魯卡品TLE模型，利用雙向凝膠電泳技術(shù)研究大鼠海馬的急性期和潛伏期蛋白質(zhì)組學變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)57種差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)根據(jù)生物學功能可以分成五大類，分別為細胞骨架蛋白、突觸相關(guān)蛋白、線粒體相關(guān)蛋白、離子通道蛋白和熱休克蛋白。國內(nèi)學者榮佳［15］、張進［16］亦對氯化鋰-匹羅卡品TLE模型的海馬蛋白質(zhì)組學進行了研究。綜合分析這些差異蛋白，推測TLE的分子發(fā)病機制可能與細胞骨架受損、突觸可塑性改變、能量代謝異常和氧化應激有關(guān)。

3.3 抗癲癇藥物作用機制、療效分析及靶點選擇的研究 Wu等［17］研究了內(nèi)側(cè)顳葉癲癇大鼠丙戊酸治療后海馬的蛋白質(zhì)組學，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期應用丙戊酸能夠防止致癇病理結(jié)構(gòu)及自發(fā)癲癇的形成，故海馬蛋白質(zhì)表達網(wǎng)絡的改變與TLE的形成密切相關(guān)，這些差異蛋白質(zhì)點可作為抗癲癇治療的潛在靶點。Paulson等［18］研究了左乙拉西坦對大鼠海馬組織細胞增殖及蛋白質(zhì)表達的影響，結(jié)果顯示左乙拉西坦并不影響海馬的細胞增殖，但能引起海馬蛋白質(zhì)表達的變化，這些差異蛋白參與細胞骨架的形成及維持、能量代謝、神經(jīng)傳遞、信號轉(zhuǎn)導、髓鞘形成和應激反應等生理過程，推測這些蛋白可能與左乙拉西坦的抗癲癇機制有關(guān)。鉤藤是一種中藥，具有抗驚厥效應，Lo等［19］研究了鉤藤對海人酸癲癇大鼠海馬蛋白質(zhì)組學的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海人酸癲癇大鼠海馬的親環(huán)素A表達下降，鉤藤治療后表達上升，結(jié)果表明親環(huán)素A可能與鉤藤的抗驚厥效應有關(guān)。

Greene［11］、榮佳［15］等通過蛋白質(zhì)組學的方法發(fā)現(xiàn)匹魯卡品TLE大鼠海馬組織中二嘧啶酶相關(guān)蛋白-2(DRP-2)表達上調(diào)。由于DRP-2能夠促進微管組裝，在軸突的生長、發(fā)育和分支以及神經(jīng)元的再生、極性的建立和維持中發(fā)揮重要作用，故推測DRP-2與顳葉癲癇形成過程中海馬異常神經(jīng)突起發(fā)芽導致的突觸重塑密切相關(guān)。因此調(diào)控DRP-2的表達或功能，可阻斷癲癇的發(fā)生、發(fā)展。研究表明［20］尼克酰胺對DRP-2有拮抗功能，能夠抑制培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元軸突生長，制止癇性發(fā)作，并已經(jīng)被FDA批準作為治療部分性發(fā)作的輔助用藥。

反應性星形膠質(zhì)細胞增生在癲癇的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］，而膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的主要成分及骨架蛋白之一，可用來特異性地標記星形膠質(zhì)細胞，并被認為是星形膠質(zhì)細胞活化的標志［22］。故深入研究GFAP表達的調(diào)控，有效控制星形膠質(zhì)細胞的增殖，可成為治療癲癇的潛在手段。Xu等［23］通過免疫組化、蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬中磷酸化信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)和GFAP表達上調(diào)，而STAT3的磷酸化抑制劑AG490能夠抑制GFAP的表達，故推測p-STAT3在癲癇的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，我們可通過調(diào)控STAT3的信號轉(zhuǎn)導通路來抑制GPAP的表達及反應性星形細胞膠質(zhì)化，進而有效治療癲癇。

4 展望

蛋白質(zhì)組學技術(shù)的開發(fā)和發(fā)展有助于我們發(fā)現(xiàn)有關(guān)TLE的形成機制、病理生理過程和臨床生物標記物，進而有利于尋找預防、診斷及治療方法。然而TLE的形成是一個復雜的生物過程，許多重要的基因、蛋白質(zhì)和信號通路組成的生物網(wǎng)絡參與其發(fā)病過程。除了差異蛋白的研究，我們需進一步探索系統(tǒng)生物網(wǎng)絡中蛋白質(zhì)的功能變化、蛋白質(zhì)間相互作用、差異基因組和功能基因組，為研發(fā)新型抗癲癇藥物及尋求行之有效的治療手段提供依據(jù)。

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