微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在惡性腫瘤研究中的進(jìn)展

陳春林(綜述)， 鄧 飛(審校)， 于燕妮

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 遵義 563000)

·綜述·

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在惡性腫瘤研究中的進(jìn)展

陳春林(綜述)， 鄧 飛(審校)， 于燕妮

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 遵義 563000)

微衛(wèi)星；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；錯(cuò)配修復(fù)基因；惡性腫瘤

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)現(xiàn)在已經(jīng)被公認(rèn)為是惡性腫瘤形成的一個(gè)新機(jī)制，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注MSI在惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用價(jià)值。自1993年[1]在遺傳性非息肉樣結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC)中發(fā)現(xiàn)有較高比例的MSI以來(lái)，在許多腫瘤如肺癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、頭頸部腫瘤、泌尿系腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、兒童胚胎性腫瘤中都報(bào)道了存在MSI。MSI已經(jīng)成為近年來(lái)分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)MSI的產(chǎn)生機(jī)制及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、早期診斷、個(gè)體化治療、監(jiān)測(cè)預(yù)后及復(fù)發(fā)等方面的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。

1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的簡(jiǎn)介

在20世紀(jì)70年代，研究者就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真核生物基因組中存在微衛(wèi)星(microsatellite，MS ) DNA，直到80年代初期,人們對(duì)微衛(wèi)星DNA才有了深入的了解。它們廣泛分布在原核和真核生物的基因組中，是短的串聯(lián)重復(fù)序列, 大約占人類基因組的10%。微衛(wèi)星由2～6個(gè)核苷酸組成，其中以二核苷酸重復(fù)序列即(CA/GT)n最為常見(jiàn)，n為重復(fù)次數(shù)，通常為15～60次。微衛(wèi)星DNA 具有高度多態(tài)性及遺傳穩(wěn)定性，即不同個(gè)體重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同，而同一個(gè)體的正常體細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中其重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)是保持不變的，其自發(fā)突變率為10-1～10-5。微衛(wèi)星已經(jīng)成為法醫(yī)個(gè)體鑒定、遺傳學(xué)圖譜制作、移植相容性檢測(cè)等的重要特殊指標(biāo)。

MSI是指由于基因復(fù)制錯(cuò)誤引起基因組中重復(fù)序列次數(shù)的增加或丟失，導(dǎo)致微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度發(fā)生了縮短或延長(zhǎng)。在基因組正常復(fù)制的情況下，如果DNA堿基發(fā)生錯(cuò)配，錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair， MMR)基因會(huì)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，保持其遺傳信息的正確性；但是如果MMR基因發(fā)生突變，則會(huì)導(dǎo)致MMR功能缺陷，不能修復(fù)錯(cuò)配堿基，從而使DNA產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤易感。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6個(gè)MMR基因即hMSH2、hMSH3 、hMSH6 、hMLHl、hPMSl和hPSM2[2]。MLH1、 MSH2、 MSH6及 PMS2四個(gè)MMR基因中的任何一個(gè)發(fā)生雜合性突變，都會(huì)引起HNPCC[3]。其中hMSH2、hMLHl在MSI的HNPCC及散發(fā)性結(jié)直腸癌中突變率較高，這些基因突變可發(fā)生在編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)，DNA修復(fù)基因、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制基因及凋亡基因都是其靶基因[4]。在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌也發(fā)現(xiàn)有hMSH2和hMLH1的突變，在子宮內(nèi)膜癌中還發(fā)現(xiàn)有hMSH3的突變。Ripperger等[5]報(bào)道了兩例由于MSH6突變導(dǎo)致MMR缺陷，進(jìn)而產(chǎn)生T細(xì)胞淋巴瘤和結(jié)腸腺癌的案例，并認(rèn)為對(duì)于兒童白血病/淋巴瘤患者而言，MMR基因的等位基因突變會(huì)引起一系列的MMR缺陷。在研究腫瘤發(fā)生時(shí)，發(fā)現(xiàn)在MSI腫瘤里頻繁的發(fā)生MMR缺陷，MSI檢測(cè)已經(jīng)成為篩選錯(cuò)配基因突變腫瘤的一個(gè)重要方法。了解腫瘤及癌前病變的MSI及其MMR 基因缺陷，以及細(xì)胞惡變的病理過(guò)程，有利于對(duì)腫瘤細(xì)胞遺傳生化的研究并了解腫瘤發(fā)生的新機(jī)制，同時(shí)，也有助于發(fā)現(xiàn)新的抑癌基因或疾病易感基因。

2 如何檢測(cè)腫瘤組織中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

大量研究表明MSI僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤相鄰的正常組織中從未發(fā)現(xiàn)MSI，說(shuō)明MS可能是一種檢測(cè)腫瘤的特異性分子標(biāo)記。目前MSI在腫瘤及遺傳病診斷方面的檢測(cè)顯示了廣闊的前景，MSI的應(yīng)用可以推動(dòng)腫瘤預(yù)防、早期診斷、早期治療及個(gè)體化治療，提高腫瘤病人的生活質(zhì)量和生存率，監(jiān)測(cè)治療后的復(fù)發(fā)。檢測(cè)MSI的方法步驟主要包括：①收集腫瘤組織及自身正常對(duì)照組織標(biāo)本；②采用傳統(tǒng)蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提基因組DNA或者是改良的試劑盒抽提基因組DNA；③設(shè)計(jì)并合成特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；④擴(kuò)增產(chǎn)物變性后行聚丙烯酰胺凝膠分離電泳，硝酸銀染色，分析結(jié)果。

美國(guó)國(guó)立癌癥研究所在1996年的會(huì)議上對(duì)HNPCC及散發(fā)性結(jié)直腸癌MSI判定擬定了推薦標(biāo)準(zhǔn)[6]，選取5個(gè)MS位點(diǎn)即BAT一25、BAT一26、D5S346、D2S125、Dl7S240，當(dāng)其中有≥2個(gè)MS位點(diǎn)出現(xiàn)不穩(wěn)定時(shí)，定義為高頻率MSI(highfrequent MSI，MSI-H)；有1個(gè)MS位點(diǎn)不穩(wěn)定時(shí)，定義為低頻率MSI(1ow frequent MSI，MSI—L)；無(wú)MS位點(diǎn)不穩(wěn)定時(shí)，定義為微衛(wèi)星穩(wěn)定(micmsatellite stability，MSS)。在之后的研究報(bào)道中，其他腫瘤在判定MSI時(shí)多數(shù)也采用了這一推薦標(biāo)準(zhǔn)。若檢測(cè)的微衛(wèi)星數(shù)目增加，當(dāng)其中有≥40%的MS位點(diǎn)出現(xiàn)不穩(wěn)定時(shí)，定義為MSI-H。

3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在腫瘤臨床應(yīng)用中的價(jià)值

3.1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與膀胱癌 染色體MS改變可能是膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)發(fā)生過(guò)程中多基因突變的一種表現(xiàn)形式。尿沉渣MSI檢測(cè)敏感性遠(yuǎn)高于尿細(xì)胞學(xué)檢查,將MSDNA作為分子標(biāo)記應(yīng)用于膀胱癌早期診斷及腫瘤治療后監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)具有臨床實(shí)用價(jià)值。1994年Mao等[7]第一次報(bào)道了在同一患者相應(yīng)的痰和尿標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)了與原發(fā)膀胱腫瘤完全相同的MSI改變，并且敏感性很高，可以將1個(gè)腫瘤脫落細(xì)胞從200～1000個(gè)正常細(xì)胞中篩選出來(lái)。因此他們認(rèn)為適當(dāng)?shù)腗S位點(diǎn)能夠作為檢測(cè)膀胱腫瘤細(xì)胞的分子標(biāo)記。Steiner等[8]檢測(cè)了11例膀胱復(fù)發(fā)腫瘤患者的尿沉渣，結(jié)果10例(90.9%)尿沉渣表現(xiàn)出MSI，說(shuō)明適當(dāng)?shù)奈⑿l(wèi)星位點(diǎn)分析對(duì)膀胱癌的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)有重要意義。呂英謙等[9]利用PCR方法檢測(cè)了35例膀胱癌患者術(shù)前尿沉渣中13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，經(jīng)微衛(wèi)星分析，31例(88.6%)可檢出膀胱癌。12例復(fù)發(fā)腫瘤中10例可見(jiàn)微衛(wèi)星改變(83%)，3例首先發(fā)現(xiàn)尿沉渣微衛(wèi)星改變，經(jīng)1～6個(gè)月繼續(xù)隨訪后，經(jīng)膀胱鏡證實(shí)發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤。由此可見(jiàn)，檢測(cè)染色體MS改變是BTCC早期診斷、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的有效手段。

3.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與結(jié)直腸癌 檢測(cè)腫瘤組織的MSI，在一定程度上可以反映出MMR基因的狀態(tài)，并且可能檢測(cè)出新的MMR基因，同時(shí)MSI的檢測(cè)比MMR基因檢測(cè)更經(jīng)濟(jì)、更簡(jiǎn)便。因此，MSI已被廣泛應(yīng)用作為散發(fā)性結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)的診斷指標(biāo)之一，特別針對(duì)家族史不完善或不符合HNPCC臨床診斷指標(biāo)的患者。Yoon等[10]使用免疫組化和MSI分析的方法評(píng)估CRC的MMR情況，免疫組化方法檢測(cè)出207(10.2%)個(gè)腫瘤樣本有MLH1或MSH2表達(dá)缺失，MSI分析有203(10%)個(gè)腫瘤樣本為MSI-H。MSI-H結(jié)腸癌與MSS結(jié)腸癌相比較, 具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)特征和分子生物學(xué)特征，原發(fā)病灶多位于右結(jié)腸、腫瘤細(xì)胞分化程度低、浸潤(rùn)組織更深、較少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、多數(shù)伴有腺瘤、且預(yù)后較好，在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌中，MSI-H型的患者5年生存率高于MSS型的患者[11]。絕大多數(shù)MSI-H 類的CRC涉及hMLHl 和hMSH2基因結(jié)構(gòu)和功能的改變, 一般表現(xiàn)為喪失表達(dá)功能蛋白的能力，少數(shù)表現(xiàn)為hMLHl基因突變或啟動(dòng)子CpG島甲基化，現(xiàn)認(rèn)為在CRC和胃癌中，MSI的發(fā)生除了生殖細(xì)胞MMR基因的突變途徑以外， 還與hMLHl 啟動(dòng)子異常甲基化有關(guān)[12]，啟動(dòng)子甲基化通常表現(xiàn)為基因雜合性丟失、基因表達(dá)能力下降或缺失、蛋白產(chǎn)物活性下降或喪失。孟文建等[13]認(rèn)為人T細(xì)胞因子4(hTCF-4)外顯子3～9突變與MSI-H散發(fā)性直腸癌患者高度相關(guān)。Herkert等[14]對(duì)4例兒童腸癌和息肉病做回顧性研究，發(fā)現(xiàn)所有病人的腫瘤顯示MSI和(或) PMS2表達(dá)缺失。MSI+的直腸癌被分為CpG島甲基化陽(yáng)性(CIMP+)和CpG島甲基化陰性(CIMP-)兩種類型， MSI+直腸癌的臨床病理特征取決于CIMP狀態(tài)[15]，CIMP+和CIMP-表現(xiàn)出不同的臨床病理特征，這可能為特異性治療MSI+的直腸癌提供線索。

3.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與女性腫瘤 乳腺癌(breast cancer, BC)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病的分子機(jī)制仍不十分明確，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康。為了尋找更有效的診斷及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志,為BC的發(fā)生及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)，研究者正在探索乳腺癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及其與乳腺癌臨床病理的關(guān)系。呂麗瓊等[16]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中普遍存在MSI，且MSI常常發(fā)生在HER2表達(dá)、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期晚期的患者中,預(yù)后較差的乳腺癌患者中MSI的發(fā)生率更高,MSI可以作為判斷乳腺癌臨床分期及預(yù)后評(píng)估的一個(gè)分子標(biāo)志。線粒體DNA(mtDNA)的突變率約為核DNA的10倍，突變形式包括缺失、插入、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等，偶然的突變即可導(dǎo)致DNA序列發(fā)生改變，使得編碼蛋白也隨之改變，進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變。mtDNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)之一。Park等[17]發(fā)現(xiàn)mtDNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定在癌癥發(fā)展的早期階段發(fā)揮了重要作用，可能是促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中活性氧生成及細(xì)胞凋亡過(guò)程。在國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期為1期的子宮內(nèi)膜腺癌中，MSI發(fā)生率高、p21表達(dá)低及生物素表達(dá)高是其預(yù)后不良的指標(biāo)[18]。

3.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與肺癌 微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性普遍存在于各種病理類型肺癌中, 是其發(fā)病機(jī)理中共有的機(jī)制，并且在不同的肺癌發(fā)展階段均可發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA改變，在肺癌發(fā)生的早期及肺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。李軍等[19]檢測(cè)肺癌支氣管沖洗加肺泡灌洗液中微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率高,特異性好,在病變?cè)缙诩纯砂l(fā)現(xiàn)。在周圍型肺癌中，聯(lián)合檢測(cè)支氣管沖洗加肺泡灌洗液中微衛(wèi)星DNA改變與脫落細(xì)胞學(xué)，發(fā)現(xiàn)兩者具有互補(bǔ)性，比傳統(tǒng)的纖支鏡活檢或刷檢敏感性高。因此這對(duì)肺癌的診斷更具有實(shí)用價(jià)值。李曼等[20]通過(guò)對(duì)肺癌進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)分析，以及對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為肺癌的發(fā)生可能存在MSI途徑，而hMLH1與hMSH2的表達(dá)失活導(dǎo)致了MSI的發(fā)生，因此，MSI可作為肺癌診斷的指標(biāo)之一。戴紀(jì)剛等[21]發(fā)現(xiàn)肺癌組織線粒體DNA的拷貝數(shù)/細(xì)胞顯著低于相對(duì)應(yīng)的正常肺組織，推測(cè)可能與控制區(qū)內(nèi)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有關(guān)。廖秀清等[22]發(fā)現(xiàn)在癌前病變組織中的MSI發(fā)生率顯著高于肺癌組織和正常肺組織，肺癌組織中MSI及p16甲基化的發(fā)生率顯著高于正常肺組織，因此認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)MSI和p16基因啟動(dòng)子甲基化可以顯著提高早期肺癌的診斷敏感性同時(shí)不降低其特異性，值得臨床廣泛推廣。

3.5 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與非霍奇金淋巴瘤 在NHL中檢測(cè)到大量的共同細(xì)胞遺傳學(xué)缺失區(qū)域(regions of common cytogeneticdeletion, RCD)，顯示抑癌基因功能的丟失與NHL的病理及臨床表現(xiàn)有著密切聯(lián)系，在這些RCD中檢測(cè)雜合性丟失(LOH)，證實(shí)存在最小分子學(xué)缺失區(qū)域(regions of minimal molecular deletion, RMD)，主要是位于第6、7、13號(hào)染色體上。Takeuchi等[23]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性兒童急性淋巴母細(xì)胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的6號(hào)染色體上的兩個(gè)MSI熱點(diǎn)：6q21-22和6q21。趙靜等[24]檢測(cè)T-NHL中6號(hào)染色體長(zhǎng)臂(6q)上多個(gè)MS位點(diǎn)的改變情況，發(fā)現(xiàn)6qLOH與T-NHL的惡性程度有相關(guān)性，6q21-22和6q25區(qū)段可能存在抑癌基因，并且它們的失活可能在T-NHL發(fā)病機(jī)制中有十分重要的作用。羅春英等[25]在探討MSI及MMR功能缺陷在非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)發(fā)病機(jī)制中的意義時(shí)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞NHL中都存在MSI和MMR蛋白表達(dá)缺陷， 其中MSI和MMR功能缺陷在B細(xì)胞NHL發(fā)病機(jī)制中的作用小，Gamberi等[26]也得出同樣的結(jié)論，他們對(duì)B細(xì)胞NHL進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析，定義2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)突變?yōu)镸SI，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一例MSI陽(yáng)性。Lee等[27]對(duì)22例胃B細(xì)胞淋巴瘤樣本中的七個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行研究，定義低于40%被檢MS位點(diǎn)陽(yáng)性為MSI-L，高于40%被檢位點(diǎn)陽(yáng)性為MSI-H，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSI-L陽(yáng)性率為40.9%(9/22)，未發(fā)現(xiàn)有MSI-H。大量文獻(xiàn)顯示MSI和MMR功能缺陷在T細(xì)胞NHL發(fā)病機(jī)制中起到十分重要的作用。對(duì)于兒童白血病/淋巴瘤患者而言, MMR功能缺陷主要與T細(xì)胞淋巴瘤有關(guān)。最近，在一些分散的與慢性免疫抑制有關(guān)的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了MSI現(xiàn)象。Borie等[28]研究了免疫缺陷相關(guān)的NHL(immunodeficiency-related non-Hodgkin lymphomas,ID-RL)的生物學(xué)、治療及臨床特征，發(fā)現(xiàn)ID-RL 中MMR缺陷的機(jī)制不同于其他散在的MSI腫瘤。

綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，MSI與NHL之間存在一定的相關(guān)性，但是其相關(guān)程度沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，原因可能與選取的樣本量大小、不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)、腫瘤的類型和臨床特征等的差異有關(guān)。

4 展望

已經(jīng)有很多腫瘤被證明與MSI有關(guān)，如原發(fā)性食管癌和原發(fā)性頭頸部腫瘤、喉鱗癌、肺癌、女性生殖系統(tǒng)腫瘤、男性泌尿系統(tǒng)腫瘤、兒童胚胎性腫瘤等。在MSI-H腫瘤中，對(duì)MSI發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。大量研究發(fā)現(xiàn)[29]，MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期診斷方面具有很高的特異性，并且伴有MSI的結(jié)直腸癌及食管癌病人預(yù)后好于不伴有MSI的病人，其原因有可能是：在各種致瘤因子刺激下產(chǎn)生MSI，從而調(diào)動(dòng)整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)及抵抗機(jī)制，繼而有較好的預(yù)后。在MSI胃癌、直結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌中，易發(fā)生HDAC2基因移碼突變及單核苷酸重復(fù)序列改變，HDACs有希望成為癌癥治療的目標(biāo)靶點(diǎn)[30]。

MSI作為惡性腫瘤常見(jiàn)的遺傳現(xiàn)象之一，作為MMR 基因突變的表型之一，作為基因突變和重排的來(lái)源之一，在腫瘤病變演進(jìn)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。應(yīng)用PCR-SSCP 方法，可以直接檢測(cè)出MSI 在細(xì)胞中的情況，間接反映出MMR 系統(tǒng)的異常。通過(guò)查找已經(jīng)發(fā)生MSI的MS位點(diǎn)，找到新的與腫瘤相關(guān)的抑癌基因，并了解其基因產(chǎn)物的作用途徑及方式，從而為新藥的研制提供了新的目標(biāo)靶點(diǎn)；同時(shí)也為臨床篩查易感人群提供了新方法，有助于惡性腫瘤的預(yù)防、診斷、個(gè)性化治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)，提高病人的生存率及生活質(zhì)量。

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R363.2

A

1000-2715(2012)01-0080-05

[收稿2011-11-18，修回2011-12-16]

(編輯：王福軍)