Nrf 2－ARE通路對心肌缺血再灌注損傷的保護作用＊

李小娟(綜述)，王海英(審校)

(遵義醫(yī)學院 麻醉系，貴州遵義 563099)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia re perfusion injury，MIRI)是臨床醫(yī)生面臨的一大難題，尤其是隨著溶栓法、介入手術、冠脈搭橋、心臟移植等治療手段的開展，MIRI問題拭待解決。據(jù)統(tǒng)計因為MIRI導致患者死亡或心力衰竭的發(fā)生率分別為10%、25%。缺血后再灌注期過量產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)導致氧化應激，氧化應激與MIRI的發(fā)生密切相關［1］。而轉(zhuǎn)錄因子NF－E2相關因子2(Nuclear factor erythroid2－related factor 2，Nrf 2)－抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)通路是目前為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路，在心血管系統(tǒng)中的分布非常廣泛，誘導激活后可上調(diào)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，從而減輕心肌的氧化損傷。同時Nrf 2是氧化應激的感受器，在參與細胞調(diào)節(jié)抗氧化應激中發(fā)揮關鍵作用，是抗氧化應激的重要轉(zhuǎn)錄因子。ARE對抗氧化應激有其獨特的誘導機制，作為順式作用元件，可與過氧化氫(H2O2)、ROS和親電子基團等外來化合物共同誘導抗氧化基因的表達。因此，研究Nrf 2－ARE通路對MIRI的保護作用在臨床上具有廣闊的應用前景及經(jīng)濟效益。本文以Nrf 2－ARE通路與心肌缺血再灌注損傷的最新研究進展作一綜述。

1 Nrf 2－ARE的基本結(jié)構

1．1 Nrf 2 Nrf 2是Moi等1994年在克隆實驗中發(fā)現(xiàn)的一種分子量為66000的新蛋白，含有一個基本的亮氨酸結(jié)構域，幾乎在各種細胞內(nèi)都可表達。Nrf 2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族，由bZIP、堿性區(qū)、酸性區(qū)、cap＇n＇collar區(qū) 4 個區(qū)組成，有 6 個高度保守的結(jié)構域為Neh1至Neh6。

1．2 ARE ARE在生物體內(nèi)的分布廣泛，是機體內(nèi)非常重要的抗氧化應激反應元件。ARE在Ⅱ相代謝酶基因啟動子5’端調(diào)控區(qū)，其核心序列(或稱共有序列)為5’2 TGACnnnGC2 3’，這一特殊的DNA啟動結(jié)合區(qū)域是誘導Ⅱ相代謝酶和親電子物質(zhì)轉(zhuǎn)錄活化所必需的，其5’端基因在激活后能誘導產(chǎn)生大量的保護性基因，轉(zhuǎn)錄因子Nrf 2轉(zhuǎn)位進入細胞核，Nrf 2首先和肌腱纖維瘤蛋白(muscle aponeurotic fibrosarcoma protein，Maf)以異二聚體的形式結(jié)合，然后該異二聚體再與ARE或親電子物反應元件(EpRE)結(jié)合，從而啟動二相酶基因的轉(zhuǎn)錄。上調(diào)一系列酶諸如:谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO－1)、谷胱甘肽半胱氨酸合成酶(GCL)等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表達［2，3］。進而抵抗各種內(nèi)外源刺激對機體產(chǎn)生的氧化應激和損傷。

2 Keap1與Nrf 2的激活

2．1 Keap1與 Nrf 2的穩(wěn)定性 90年代末期，Yamamoto等發(fā)現(xiàn)在誘導信號傳遞給細胞核內(nèi)ARE的過程中，兩種信號蛋白質(zhì)參與了傳遞，一種是Nrf 2，另一種是Keap1。Keap1是相對分子量為69000的蛋白質(zhì)，在胞漿中錨定于肌動蛋白細胞骨架上。Keap1的IVR區(qū)參與泛素化連接酶形成，親電化合物及氧化劑與Keap1的反應發(fā)生在插入?yún)^(qū)IVR，所以與Nrf 2穩(wěn)定性有關［4］。有研究報道，未受誘導的細胞內(nèi)生的Nrf 2消除很快，其半衰期約為20 min。目前，對于Nrf 2與Keap1的關系多數(shù)學者的觀點是:生理狀態(tài)下，Keap1在細胞質(zhì)內(nèi)以二聚體的形式結(jié)合一個Nrf 2分子，將其控制在胞漿中，這樣，Nrf 2處于非游離并不斷降解的非活性狀態(tài)，使保護細胞的酶類和抗氧化物處于基礎表達水平。當胞漿中的Nrf 2被釋放出來，且與泛素脫離，其穩(wěn)定性就明顯提高。但這并不是說游離的Nrf 2就不降解，只是其降解的速度明顯減慢［5］。

2．2 Nrf 2的激活及核轉(zhuǎn)位 目前大多數(shù)觀點認為，Nrf 2的活性主要由Keap1負性調(diào)節(jié)。Nrf 2的激活即Nrf 2與Keap1的解離可在以下兩種情況下發(fā)生:一是當受到親電試劑或ROS的攻擊時Keap1中的巰基改變;二是通過蛋白激酶C(PKC)途徑使Nrf 2磷酸化，Nrf 2和Keap1解離后Nrf 2轉(zhuǎn)位進入細胞核，與ARE元件識別并結(jié)合，從而啟動下游Ⅱ相解毒酶等保護性基因的轉(zhuǎn)錄，提高細胞的抵抗氧化應激的能力。最近有研究發(fā)現(xiàn)使用活性氧及氮族化合物處理細胞后，Keap1分子內(nèi)部通過Cys151形成了二硫鍵，繼而激活Nrf 2，使Nrf 2與Keap1解離，核轉(zhuǎn)位進入細胞核［6］。但具體由何種激酶激活取決于相應的刺激因素及細胞類型。

2．3 Nrf 2的降解 細胞的氧化－還原平衡一旦恢復，Nrf 2與ARE元件解離，輸出到胞漿，通過E3泛素連接酶泛素化后降解，關閉Nrf 2通路，重新維持低基礎水平的Nrf 2。

3 MIRI與氧化應激

MIRI是指在組織器官缺血恢復血流后，其細胞代謝功能障礙及結(jié)構破壞反而加重、甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。IRI的始動因素是缺血缺氧，包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷。1960年Jennings等人首次提出MIRI以來，到現(xiàn)在MIRI的病理生理機制還未完全闡明，其發(fā)病機制可能與氧自由基、鈣超載、炎癥反應、細胞凋亡、蛋白激酶途徑等有關［7，8］。再灌注期過量產(chǎn)生的ROS介導產(chǎn)生的氧化應激是導致MIRI的主要機制，采用外源性自由基清除劑可減輕心肌損傷［9，10］。ROS是雙刃劍，雖然ROS低濃度時在正常的細胞代謝和信號轉(zhuǎn)導中充當介質(zhì)具有重要作用，但較高濃度的ROS對細胞有害。有研究報道，ROS不但能夠引起急性缺血期損傷，在再灌注期，與炎性反應介質(zhì)釋放和白細胞浸潤密切相關的ROS會進一步加重急性缺血損傷。也有研究表明，大量ROS可抑制線粒體的氧化磷酸化，使能量合成不足;在心肌再灌注的早期，氧自由基的釋放及抗氧化酶活性降低，可導致心肌細胞嚴重受損，而ROS的清除和調(diào)整因子能夠增強內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的作用，對抗IRI。因此，及早有效地進行抗氧化應激治療，清除ROS，可明顯減輕MIRI并改善心功能狀態(tài)。綜上所述，氧化應激在MIRI的發(fā)生中起著關鍵性的作用，尋找調(diào)控氧化應激的靶點將為對抗MIRI開辟新的道路。

4 Nrf 2－ARE通路、氧化應激、MIRI的關系

4．1 Nrf 2－ARE通路與氧化應激 細胞受外源性或內(nèi)源性氧化應激刺激后，Nrf 2活化從Keap1解離后進入細胞核，在核內(nèi)與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識別并結(jié)合ARE，進而啟動受ARE調(diào)控的基因的轉(zhuǎn)錄［11］，提高抗氧化損傷能力，這一路徑即為Nrf 2－ARE通路。氧自由基及相關代謝產(chǎn)物過量聚集，超過機體代償能力，導致體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡狀態(tài)破壞，進而引起脂質(zhì)過氧化，最終引起細胞代謝障礙，直接或間接干擾細胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的生理功能，對機體細胞造成損傷，即氧化應激損傷。

Nrf 2－ARE通路是內(nèi)源性抗氧化應答機制中最為重要的信號通路之一，處于氧化應激的中心地位。其作用通過以下方式發(fā)揮，氧化應激期間，一方面，氧化應激可加速 Nrf 2的mRNA轉(zhuǎn)錄，增加Nrf 2蛋白合成，另一方面，氧化應激導致Keap1－Nrf 2復合體解離，使游離的Nrf 2增加，進入細胞核內(nèi)的Nrf 2增加，然后通過上調(diào)其下游抗氧化蛋白及二項解毒酶基因的表達從而減輕氧化損傷［12］。所以，ARE的激活是Nrf 2－ARE通路調(diào)節(jié)細胞抗氧化應激的關鍵，研究表明，采用轉(zhuǎn)染了pGL4－ARE重組質(zhì)粒的HEK－293細胞來研究白藜蘆醇抗氧化作用的機制發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可明顯激活Nrf 2－ARE通路，上調(diào)Nrf 2水平，過量的Nrf 2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與ARE結(jié)合，啟動下游基因表達，提高抗氧化酶GST和SOD的活性，從而實現(xiàn)其抗氧化應激作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)多種抗氧化劑均通過Nrf 2－ARE通路發(fā)揮抗氧化作用，如金絲桃苷可通過Nrf 2－ARE通路介導抗氧化蛋白HO－1表達提高，減輕氧化損傷［14］。

到目前為止，已證實經(jīng)Nrf 2－ARE信號途徑調(diào)節(jié)的內(nèi)源性保護基因超過200個，主要包括3大類:(1)細胞內(nèi)氧化還原基因，如HO－1;(2)Ⅱ相解毒基因，如谷胱甘肽－S轉(zhuǎn)移酶和醌氧化還原酶－1(NQO－1)等;(3)編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因，如多藥耐藥蛋白(MRP)等［15］。有研究認為，通過Nrf 2途徑上調(diào)血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞等Ⅱ項解毒酶及抗氧化蛋白的表達，可減輕大量氧自由基造成的心血管系統(tǒng)的急慢性損傷［16］?？寡趸割愔饕ㄟ^催化自由基轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)和增加其水溶性而使自由基排除，達到維持機體氧化還原平衡的目的［17］。Nrf 2基因敲除小鼠對線粒體應激及缺血的敏感性明顯增加，也提示Nrf 2－ARE通路是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化應激的關鍵。Nrf 2基因敲除后發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)包括過氧化氫酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶、NQO－1、HO－1、谷胱甘肽過氧化物、谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶、SOD1等表達降低，增加了對氧化應激的敏感性［18］。

4．2 Nrf 2－ARE通路對MIRI的保護作用 目前缺血性心臟病的發(fā)病率處于原發(fā)性心臟病首位，其中心肌缺血再灌注損傷約占50%以上。近年發(fā)現(xiàn)的Nrf 2在心血管系統(tǒng)具有穩(wěn)定的表達，大量研究證實Nrf 2－ARE通路在MIRI中發(fā)揮重要保護作用。盡管目前對Nrf 2－ARE通路對MIRI具體的保護機制學說眾說紛紜，通過減少ROS抗氧化應激損傷、減輕鈣超載、抗炎癥、抗心肌細胞凋亡等，各機制相互聯(lián)系，相互滲透，抗氧化應激學說目前研究最為廣泛。實驗證明，多種藥物通過Nrf 2－ARE通路介導抗心肌缺血再灌注損傷保護作用。研究表明大量的醛類物質(zhì)堆積是導致缺血再灌注損傷的主要原因。Zhan等［19］的研究發(fā)現(xiàn)5mol/L的4－羥基壬烯醛預處理可通過激活Nrf 2表達和刺激谷胱甘肽的生物合成來使心肌細胞對4－羥基壬烯醛的細胞毒性產(chǎn)生耐受作用，減輕IRI引起的心肌細胞損傷。同時，有研究顯示，由細胞因子TNF－A刺激產(chǎn)生的ROS廣泛參與各種缺血性心肌損傷的病理生理過程，TNF－A能激活Nrf 2，升高谷胱甘肽的濃度，通過Nrf 2－ARE通路介導對HL－1心肌細胞的保護作用［20］。

朱曉潔等［21］利用鈷原卟啉預處理缺氧/復氧H9C2心肌細胞，并用抑制劑分別抑制HO－1及Nrf 2－ARE，檢測細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、膽堿激酶(CK)的水平變化，同時采用Western blot分析HO－1、Nrf 2的蛋白表達水平，RT－PCR法分析HO－1mRNA表達水平，結(jié)果表明鈷原卟啉預處理通過誘導H9C2心肌細胞HO－1過表達發(fā)揮對缺氧/復氧損傷心肌細胞的保護作用，其保護作用機制與Nrf 2－ARE通路相關。Li等［22］的研究也發(fā)現(xiàn)，美國西洋參可抑制雙氧水誘導H9C2心肌細胞的損傷，也是通過激活Nrf 2通路發(fā)揮作用。

Nrf 2及其調(diào)控的下游抗氧化基因參與了MIRI的保護機制。研究顯示，敲除Nrf 2基因的小鼠細胞內(nèi)抗氧化劑及二相酶的基態(tài)表達遠遠低于正常小鼠，對ROS引起的細胞毒性敏感性增加，說明抗氧化基因?qū)ΡＷo氧化性心肌損傷至關重要，Nrf 2的表達參與了成纖維細胞中抗氧化劑和二相酶的表達和誘導，Nrf 2基因敲除提高成纖維細胞對ROS引起的細胞損傷的敏感性［23］。綜上所述，氧化應激是導致IRI的關鍵因素，而Nrf 2－ARE通路可有效抑制氧化應激，說明通過Nrf 2－ARE通路調(diào)控氧化應激來對抗MIRI具有重要意義。

5 展望

20世紀90年代發(fā)現(xiàn)Nrf 2轉(zhuǎn)錄因子以來，各領域?qū)ζ湔归_了廣泛地研究，Nrf 2－ARE通路作為內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，可有效抑制氧化應激。在心血管系統(tǒng)，目前主要集中在Nrf 2－ARE通路抗MIRI機制的研究，本課題組在既往對缺血預處理、藥物預處理、抗心肌缺血再灌注炎性反應的基礎上，以Nrf 2為靶點，從細胞分子水平揭示后處理心肌保護作用的機制及Nrf 2－ARE通路的激活機制。隨著對Nrf 2－ARE通路在抗MIRI方面作用的認識及其作用機制的更深一步了解，開發(fā)調(diào)控Nrf 2－ARE通路為靶點的藥物在臨床抗心肌缺血再灌注損傷的預防和治療中具有很好的應用前景。

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