熱休克蛋白-肽復(fù)合物與腫瘤免疫

牛保華，齊義軍，晁瑋霞，馬遠(yuǎn)方

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類在生物進(jìn)化過程中高度保守，廣泛表達(dá)于所有生命機(jī)體組織細(xì)胞并具有管家功能的蛋白質(zhì)。根據(jù)分子量的差異，HSP 可分為10個(gè)家族，包括 HSP110/grp170、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27等，每個(gè)家族有 1～5個(gè)成員[1]。在正常生理狀態(tài)下，HSP的結(jié)構(gòu)性表達(dá)約占細(xì)胞蛋白質(zhì)組的5%。HSP 作為分子伴侶，參與蛋白折疊、蛋白降解、蛋白復(fù)合體組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)、抗原處理、蛋白定位等生物學(xué)過程。高溫、毒素、氧化、糖原耗竭等應(yīng)激狀態(tài)可誘導(dǎo) HSP的表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的HSP 可達(dá)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的15%，增加的HSP能夠快速短暫地保護(hù)細(xì)胞免受損傷，增加細(xì)胞的修復(fù)功能，維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞中關(guān)鍵分子通路的完整性[2]。近年來發(fā)現(xiàn) HSP 與腫瘤免疫密切相關(guān)，本文就 HSP-肽復(fù)合物抗腫瘤的分子免疫機(jī)制及以 HSP 為免疫佐劑的腫瘤疫苗作一綜述。

1 HSP-肽復(fù)合物免疫原性

某些 HSP能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)降解的許多肽段構(gòu)成 HSP-肽復(fù)合物，如位于胞漿的HSP90和HSP70 及位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的gp96、calreticulin、HSP110和HSP170。HSP-肽復(fù)合物相當(dāng)穩(wěn)定，可以耐受常規(guī)的生化、物理分離純化過程，HSP-肽復(fù)合物通常攜有大量的非共價(jià)結(jié)合的多肽分子[2]。因此，熱休克蛋白相結(jié)合的肽庫在一定程度上代表了其來源組織細(xì)胞的蛋白構(gòu)成。

HSP-肽復(fù)合物具有免疫原性，從腫瘤或病毒感染的組織細(xì)胞中分離純化的HSP能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，而來源于正常組織的HSP 卻沒有這種功能。HSP-肽復(fù)合物的抗腫瘤活性起始于gp96，之后發(fā)現(xiàn)HSP70、HSP90、calreticulin、HSP110 及GRP170 均具有這種特異的免疫防御功能。從 HSP 中解離出其結(jié)合的多肽分子后，會(huì)導(dǎo)致 HSP 免疫保護(hù)功能完全喪失，體外重組的HSP-多肽復(fù)合分子具有相同的免疫保護(hù)功能[3]。越來越多的證據(jù)充分證實(shí)：HSP的免疫原性來源于HSP結(jié)合的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞內(nèi)蛋白降解生成的多肽，而不是 HSP 分子本身所具有的功能，從腫瘤組織細(xì)胞分離純化 HSP的生物化學(xué)過程并沒有影響到 HSP的分子伴侶功能[4]。在免疫原性方面，gp96和HSP70 誘導(dǎo)的免疫保護(hù)反應(yīng)強(qiáng)于其他的HSP 分子，而 gp96 在誘導(dǎo)機(jī)體抗原特異性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)能力方面優(yōu)于其他同類分子[3]。

2 HSP-肽復(fù)合物誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫的分子機(jī)制

一般來講，內(nèi)源性抗原是通過 MHC I 類分子提呈，外源性抗原通過 MHC II 類分子提呈。在HSP-肽復(fù)合物誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫反應(yīng)過程中，HSP 發(fā)揮了中轉(zhuǎn)作用，對細(xì)胞漿來源的多肽進(jìn)行處理后轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后介導(dǎo) MHC I 類分子與抗原肽結(jié)合，屬于抗原交叉提呈范疇[5]。最近的研究表明：抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）表面的HSP 受體，如 CD91、LOX1、SR-A等，在識別與內(nèi)吞 HSP-抗原肽復(fù)合物、抗原的交叉呈遞至 MHC 分子過程中起著關(guān)鍵作用。gp96-肽復(fù)合物并不能直接激活 T 細(xì)胞，而是通過巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dentritic cells，DC）及B 細(xì)胞等 APC 表面的CD91 受體介導(dǎo)，受體-gp96-抗原肽復(fù)合物被內(nèi)吞后進(jìn)入 APC的內(nèi)體，內(nèi)體中的低 pH環(huán)境可能促進(jìn)了抗原肽解離，gp96 與MHC I 類分子的相互作用激活了 gp96的ATP 酶活性，ATP 水解釋放的能量使抗原肽由 gp96 轉(zhuǎn)移到 MHC I 類分子[6]。此外，gp96 還能誘導(dǎo) DC的成熟并同時(shí)下調(diào) DC 表面的受體，使 DC失去了與gp96結(jié)合的能力，成熟的DC能直接刺激 T 細(xì)胞，啟動(dòng) CTL 效應(yīng)[7]。

與MHC 類分子類似，HSP能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的抗原肽。但與MHC 分子不同的是，由于HSP 沒有多態(tài)性，即正常組織與疾病組織中的HSP的基因序列并沒有差異。因此，與HSP 相互作用的多肽更廣泛、不受 MHC 限制，能結(jié)合MHC 類分子之外更多的多肽分子[8]。此外，HSP 還能促進(jìn)APC的表型和功能成熟，如 HSP 刺激后DC 表面 MHC II 類分子、CD86和CD83等分子的表達(dá)上調(diào)，以及細(xì)胞因子和化學(xué)因子等前炎癥因子的分泌增加[2,9]。HSP70-和gp96-肽復(fù)合物還能刺激自然殺傷細(xì)胞增殖并使其激活[10]。因此，HSP 分子除了擔(dān)當(dāng)抗原肽的載體，還具有免疫佐劑的免疫刺激功能，同時(shí)誘導(dǎo)天然性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，故HSP 用于腫瘤的免疫治療具有無可替代的優(yōu)勢。

3 HSP-肽復(fù)合物腫瘤疫苗及臨床應(yīng)用

由于HSP 介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)來源于其結(jié)合的抗原肽，因而體外重組的HSP-抗原肽復(fù)合物亦能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生類似的特異性的腫瘤清除反應(yīng)。與MHC 分子結(jié)合的多肽分子不同，HSP結(jié)合的多肽非常廣泛，不受抗原肽表位的影響，因而具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。由 gp96 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所需多肽的量極少，研究表明 1～2 ng人工合成的多肽與gp96結(jié)合后，一方面既可交叉呈遞給 MHC I 類分子啟動(dòng)CD8+ T 細(xì)胞反應(yīng)，另一方面還能提呈抗原到 MCH II 類分子，最終刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的腫瘤特異的免疫反應(yīng)[3,5]。

故而，基于HSP-多肽復(fù)合物的腫瘤特異性疫苗為腫瘤免疫治療提供了廣闊的應(yīng)用前景，其具有 3個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：①HSP 介導(dǎo)的免疫殺傷作用并不需要對免疫性多肽的表位進(jìn)行鑒定，而臨床上腫瘤患者有著不同的個(gè)體差異，這樣就免除了對不同類型和不同個(gè)體的腫瘤的免疫保護(hù)抗原進(jìn)行鑒定的必要；②來自于腫瘤的HSP-抗原肽復(fù)合物包含有大量不同的免疫原性多肽，因而其介導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)針對的是腫瘤組織細(xì)胞中所有特異的抗原庫，降低了免疫逃逸發(fā)生的可能性；③同一種屬內(nèi) HSP 沒有多態(tài)性，不受 MHC I類抗原限制，可在同種內(nèi)廣泛應(yīng)用。在小鼠和大鼠的腫瘤模型中，當(dāng) HSP 復(fù)合物介導(dǎo)的免疫治療作為輔助手段時(shí)，在腫瘤被完全切除之后，所有的接受 HSP 復(fù)合物免疫治療的動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都能保持無瘤狀態(tài)；但對沒有切除、進(jìn)展性的腫瘤，僅能維持腫瘤的穩(wěn)定，僅少數(shù)病例可見腫瘤實(shí)體的縮小[2]。

基于HSP-多肽復(fù)合物的廣譜抗腫瘤活性，這種輔助治療手段的適應(yīng)癥包括了各種組織類型的腫瘤。目前已有多個(gè)應(yīng)用自體純化的HSP-肽復(fù)合物對腫瘤進(jìn)行免疫治療的I和II 期臨床試驗(yàn)，具有一定的療效。gp96-肽復(fù)合物疫苗已應(yīng)用于多種不同組織類型的腫瘤，如胰腺癌、胃腸道腫瘤、淋巴組織腫瘤、慢性骨髓性白血病、腎癌及皮膚的黑色素瘤等[11]。

自最初發(fā)現(xiàn) gp96-肽復(fù)合物抗腫瘤活性后，已有許多自體腫瘤組織 gp96-肽復(fù)合物提取物對腫瘤患者治療的臨床試驗(yàn)。應(yīng)用自體腫瘤 gp96-肽復(fù)合物提取物治療黑色素瘤患者的臨床 II 及III 期試驗(yàn)，目前已有 4 篇報(bào)道。di Pietro等[12]綜合分析后發(fā)現(xiàn)：自體免疫后腫瘤特異性 CTL 反應(yīng)增強(qiáng)患者的預(yù)后顯著好轉(zhuǎn)，gp96-肽復(fù)合物與其他免疫治療方案結(jié)合后療效更為顯著。20 例晚期黑色素瘤已發(fā)生多處轉(zhuǎn)移的患者，25 μg 自體 gp96-肽復(fù)合物皮內(nèi)注射作為黑色素瘤輔助治療，經(jīng)過 10年隨訪 11 例IV 期患者發(fā)現(xiàn)：45%的患者疾病沒有進(jìn)展，10年整體生存率為82%[13]。對發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移的29 例結(jié)腸癌患者，應(yīng)用手術(shù)切除的肝轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本制備自體 gp96-肽復(fù)合物腫瘤疫苗，經(jīng)過兩個(gè)周期的治療，患者外周血淋巴細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）檢測顯示：15 例（52%）患者激發(fā)了新的HLA I 限制性特異性殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的CTL 反應(yīng)或原有的CTL 反應(yīng)顯著增強(qiáng)；同時(shí)，這些患者外周血中 CD3+、CD45RA+和CCR7-T 淋巴細(xì)胞明顯增加；結(jié)腸癌特異性 CTL 反應(yīng)增加患者無瘤生存期較無反應(yīng)者明顯延長[14]。國內(nèi)學(xué)者也應(yīng)用HSP-肽復(fù)合物治療 32 例原發(fā)性肝癌患者，結(jié)果顯示：治療 3個(gè)月后，治療組的CD3+、CD8+ 細(xì)胞明顯升高，CD4+/CD8+ 細(xì)胞的比值下降，NK 細(xì)胞的活性也較治療前顯著增強(qiáng)；治療組的3年生存率為68.8%，較對照組的37.5% 明顯升高[15]。此外，還有學(xué)者利用 DNA-HSP65 腫瘤疫苗治療晚期頭頸部鱗癌，21 例患者被分為3組，分別接受 3個(gè)劑量瘤體內(nèi)注射，治療一個(gè)周期（3周）后，發(fā)現(xiàn) 4 例可檢測到外周血淋巴細(xì)胞分泌 IL-10 增加，5 例患者治療后病情穩(wěn)定或腫瘤消退，2 例完成治療的患者 3年后仍存活，提示 HSP是腫瘤治療的新靶點(diǎn)，具有美好的應(yīng)用前景[16]。也有學(xué)者應(yīng)用 gp96-肽復(fù)合物免疫治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，無論是對于復(fù)發(fā)還是新近診斷的膠質(zhì)瘤患者，治療組的中位生存期均從 26周增至 44周。

目前為止已完成了多個(gè) HSP-多肽復(fù)合物治療多種腫瘤臨床試驗(yàn)，但均不是隨機(jī)臨床試驗(yàn)；盡管如此，腎癌、胰腺癌和黑色素瘤的HSP-多肽復(fù)合物免疫治療顯示了較好的臨床療效，與動(dòng)物模型觀測的結(jié)果一致[2]。以上結(jié)果提示HSP-肽復(fù)合物腫瘤疫苗能有效地治療特定腫瘤、降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。

4 重組多價(jià) HSP-肽復(fù)合物腫瘤疫苗

然而，個(gè)體化的HSP-肽復(fù)合物腫瘤疫苗并不適用于所有的腫瘤患者，尤其是無手術(shù)機(jī)會(huì)及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期患者，腫瘤患者不能提供足夠腫瘤組織以制備自體腫瘤疫苗，供自體長期治療使用。其次，腫瘤組織來源有限，繁雜的純化制備過程難以標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制，既是制備自體疫苗所面臨的挑戰(zhàn)，還阻礙了其大規(guī)模生產(chǎn)。第三，HSP-抗原肽復(fù)合物半衰期較短，阻止了腫瘤疫苗的長期使用。

相對腫瘤患者自體來源的HSP-肽復(fù)合物疫苗，體外重組HSP-肽復(fù)合物疫苗具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)：①HSP 高效結(jié)合的肽類分子所構(gòu)成的復(fù)合物疫苗可高濃度刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；②HSP 可結(jié)合多個(gè)具有不同 CTL表位的抗原肽，供個(gè)體的抗原提呈細(xì)胞的MHC 分子選擇，產(chǎn)生針對不同抗原表位的多克隆 T和（或）B 細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，降低免疫逃逸的發(fā)生；③重組HSP-肽疫苗仍適用于不能提供腫瘤組織的晚期、術(shù)后復(fù)發(fā)癌癥患者，尤其適用于腫瘤易患人群或術(shù)后高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向的患者的預(yù)防性治療；④重組HSP-肽腫瘤疫苗生產(chǎn)成本低，可大規(guī)模、高質(zhì)量的工業(yè)化生產(chǎn)；⑤選擇不同 HLA 限制性的免疫優(yōu)勢CTL 表位肽構(gòu)成多價(jià)重組疫苗而非整個(gè)腫瘤組織或細(xì)胞，有益于更好地理解認(rèn)識重組HSP 疫苗的腫瘤特異性免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。

5 結(jié)語

由于腫瘤細(xì)胞遺傳的不穩(wěn)定性，腫瘤患者確診時(shí)其腫瘤細(xì)胞/組織內(nèi)已發(fā)生了約 10000的基因突變等分子事件；由基因突變導(dǎo)致異常蛋白的數(shù)量更多。同時(shí)，隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)周圍惡劣的微環(huán)境，如低氧、酸性環(huán)境、腫瘤患者治療過程中的放化療等，發(fā)生惡性變的細(xì)胞需要大量伴侶蛋白的保護(hù)功能，使細(xì)胞能夠繼續(xù)生存，因而，細(xì)胞內(nèi)伴侶蛋白的表達(dá)量整體上調(diào)，尤其是 HSP90 家族。與正常組織相比，腫瘤組織不僅表達(dá) HSP的量增加，而且 HSP的伴侶功能增強(qiáng)，如高表達(dá)的gp96 與突變異常的靶蛋白和多肽分子親合力增加，因而 HSP結(jié)合的蛋白或多肽構(gòu)成了腫瘤特異的抗原指紋，奠定了腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。近年來，隨著免疫學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，使篩選優(yōu)勢 CTL 表位肽成為可能。通過鑒定特定腫瘤組織中 HSP結(jié)合的多肽抗原指紋圖譜，利用分子模擬技術(shù)篩選優(yōu)勢CTL 表位肽，體外重組多價(jià) HSP-肽復(fù)合物抗原腫瘤疫苗，將會(huì)給腫瘤的免疫治療帶來新的希望。

[1]Gething MJ, Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature, 1992,355(6355):33-45.

[2]Srivastava P.Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity.Nat Rev Immunol, 2002, 2(3):185-194.

[3]Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al.Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.J Exp Med,1997, 186(8):1315-1322.

[4]Udono H, Levey DL, Srivastava PK.Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vitro.Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(8):3077-3081.

[5]Srivastava PK, Udono H, Blachere N, et al.Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming.Immunogenetics, 1994, 39(2):93-98.

[6]Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-peptide complexes.Curr Oncol Rep, 2005, 7(5):104-108.

[7]Singh-Jasuja H, Toes RE, Spee P, et al.Cross-presentation of glycoprotein 96-associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor-mediated endocytosis.J Exp Med, 2000, 191(11):1965-1974.

[8]Tamura Y, Peng P, Liu K, et al.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations.Science,1997, 278(5335):117-120.

[9]Basu S, Srivastava PK.Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity.J Exp Med, 1999, 189(14):797-802.

[10]Elsner L, Muppala V, Gehrmann M, et al.The heat shock protein HSP70 promotes mouse NK cell activity against tumors that express inducible NKG2D ligands.Immunol, 2007, 179(9):5523-5533.

[11]Segal BH, Wang XY, Dennis CG, et al.Heat shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer.Drug Discov Today, 2006,11(11-12):534-540.

[12]di Pietro A, Tosti G, Ferrucci PF, et al.Heat shock protein peptide complex 96-based vaccines in melanoma: How far we are, how far we can get.Hum Vaccin, 2011, 5(11):727-737.

[13]Eton O, Ross MI, East MJ, et al.Autologous tumor-derived heat-shock protein peptide complex-96 (HSPPC-96) in patients with metastatic melanoma.J Transl Med, 2010, 8:9.

[14]Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, et al.Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer.Clin Cancer Res, 2003, 9(9):3235-3245.

[15]Zhao ZL, Yan L, Cui JD, et al.HSP-peptide complex vaccine in preventing postoperative recurrence of hepatocarcinoma: 32 cases report.Journal of the Fourth Military Medical University, 2005,26(22):2076-2078.(in Chinese)趙子粼, 鄢莉, 崔建東,等.熱休克蛋白抗原肽復(fù)合物疫苗預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)32例.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26(22):2076-2078.

[16]Michaluart P, Abdallah KA, Lima FD, et al.Phase I trial of DNA-hsp65 immunotherapy for advanced squamous cell carcinoma of the head and neck.Cancer Gene Ther, 2008, 15(10):676-684.