注射用血凝酶體內(nèi)外止血作用的研究

王兆鉞(蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，衛(wèi)生部血栓與止血重點實驗室，江蘇蘇州 215006)

出血在臨床上相當常見，約占血液病門診的1/3，除血液科外，臨床各科也都有出血問題。引起出血的最主要原因為血小板量或質(zhì)的異常和凝血障礙，先天性或獲得性血管異常、纖溶亢進以及循環(huán)中抗凝物質(zhì)增多等因素也可導致出血。在有嚴重出血時，需要給予止血藥幫助止血。臨床上有效的止血藥不多，并且都有一定的局限性。維生素K只對維生素K依賴性凝血因子減少的出血有效。去氨加壓素(DDAVP，彌凝)對1型血管性血友病(vWD)有良好的治療效果，亦可作為輕、中癥血友病的首選藥物。抗纖溶藥(氨甲苯酸與氨甲環(huán)酸等)抑制纖維蛋白的水解，主要用于手術創(chuàng)傷、體外循環(huán)、肝臟疾病或腫瘤等引起的纖溶亢進或原發(fā)性纖溶活性過強所引起的出血;適用于伴有纖溶亢進的出血。重組的因子Ⅶa的適應證為有抑制物的血友病A與血友病B與先天性因子Ⅶ缺乏，對嚴重的血小板病與嚴重肝臟疾病也有較好的效果［1］;但價格昂貴，半衰期短。其他止血藥，如卡絡磺鈉與止血敏等缺乏大規(guī)模的臨床驗證，其確切效果難以肯定。臨床上需要有廣譜、安全可靠的止血藥。

注射用血凝酶(巴曲亭)為巴西矛頭蝮蛇(bothrops atrox)毒液中分離出來的止血成份，包括2種有效成分:巴曲酶及少量凝血因子Ⅹ激活物(FⅩA)。巴曲酶直接作用于纖維蛋白原Aα鏈Arg16-Gly17處，釋放纖維蛋白肽A后形成纖維蛋白單體Ⅰ，但不降解纖維蛋白B肽，亦不直接激活FⅩⅢ，因此不能形成穩(wěn)定的纖維蛋白。FⅩA可以直接激活FⅩ，從而激活凝血酶原，使纖維蛋白原降解成纖維蛋白，并激活FⅩⅢ，形成穩(wěn)定的纖維蛋白。注射用血凝酶已廣泛用于神經(jīng)外科、婦科與骨科手術以及消化道與呼吸道出血，臨床上有較滿意的止血效果［2，3］，我們對其體內(nèi)外止血作用進行了較完整研究。

1 注射用血凝酶及其有效成分對凝血的影響

活化的部分凝血活酶時間(aPTT)反映了內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的活性;而凝血酶原時間(PT)反映了外源性凝血系統(tǒng)的活性。FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶均能縮短正常人血漿的aPTT;隨著濃度的增大，縮短aPTT的作用越明顯，其中FⅩA的作用在一定劑量范圍內(nèi)存在量效關系(r=0.889，P＜0.05)。當FⅩA濃度為0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶在濃度為0.05 U·mL-1時，可使正常人血漿的APTT縮短10 s左右，這表明注射用血凝酶及其有效成分可以促進血漿的凝血過程。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都對凝血酶原時間(PT)無明顯影響。這是由于檢測PT的試劑中含有一定量的肝素，而注射用血凝酶及其有效成份不能拮抗肝素的抗凝作用。

2 注射用血凝酶及其有效成分對出血性疾病止血異常的作用

各種凝血疾病的病理機制不同。血友病A為缺乏凝血因子Ⅷ，血友病B為缺乏凝血因子Ⅸ，維生素K依賴性凝血因子缺乏癥為凝血酶原、因子Ⅶ、Ⅸ與Ⅹ減少，vWD為 von Willebrand因子量的缺乏或質(zhì)的異常。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，當FⅩA濃度＞0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶濃度＞0.05 U·mL-1時，可完全糾正血友病A患者血漿aPTT的延長。因此在出血性疾病的實驗研究中選用以上的FXA、巴曲酶與注射用血凝酶濃度。注射用血凝酶及其有效成分可完全糾正血友病A、血友病B、維生素K依賴性凝血因子缺乏癥、FⅤ缺乏癥與vWD患者血漿aPTT的延長，對FⅩ缺乏癥患者aPTT的延長也能明顯縮短(P＜0.001)，而對無纖維蛋白原血癥患者血漿的aPTT無明顯影響。這些體外實驗結果提示注射用血凝酶及其有效成分能糾正除無纖維蛋白原血癥以外的凝血疾病的止血缺陷。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶不能糾正FⅤ、FⅦ、FⅩ缺乏癥、維生素K依賴性凝血因子缺乏癥患者與無纖維蛋白原血癥患者PT的延長。

3 注射用血凝酶及其有效成分對FⅩ活化的影響

FⅩA可以活化純化的FⅩ或正常人血漿中的FⅩ，且隨著FⅩA濃度的增加，F(xiàn)Ⅹa的濃度也相應升高(r=0.889，P＜0.05)，但由于仍有少量的FⅩ尚未被完全活化，F(xiàn)Ⅹa的濃度低于FⅩ的濃度。對部分出血性疾病，如血友病A、血友病B與VWD患者，F(xiàn)ⅩA可明顯使其血漿中的FⅩ活化;而FⅩ缺乏癥患者及維生素K依賴性凝血因子缺乏癥患者血漿由于缺乏FⅩ，F(xiàn)Ⅹa升高不明顯。巴曲酶不作用于FⅩ;而注射用血凝酶中僅含有少量FⅩA，尚不足以激活FⅩ。

4 注射用血凝酶及其有效成分對凝血酶生成的影響

FX是凝血酶原酶的最主要成分，活化后使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，后者將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，導致了血液的凝固。FⅩA可明顯促進正常人血漿中凝血酶的生成，但與FⅩA濃度無明顯線性相關關系。對血友病A、血友病B、vWD、FⅩ缺乏癥患者及維生素K依賴性凝血因子缺乏癥患者亦能明顯促進其凝血酶生成(P＜0.005)。但巴曲酶及注射用血凝酶對正常人血漿及出血性疾病患者的凝血酶生成作用不明顯。巴曲酶不作用凝血酶原;而注射用血凝酶中少量的FⅩA，尚不足以激活FⅩ與凝血酶原，主要依靠巴曲酶發(fā)揮止血作用，因此低劑量的FⅩA僅具有加強止血的效果。

5 注射用血凝酶及其有效成分對纖維蛋白形成及纖溶系統(tǒng)的影響

注射用血凝酶與巴曲酶均可水解纖維蛋白原A肽，在0.05 U·mL-1濃度時使血漿纖維蛋白原A肽水平增加60倍;FⅩA通過激活FⅩ與凝血酶原水解纖維蛋白原A肽與B肽，在0.000 5 U·mL-1濃度時能使血漿纖維蛋白原A肽水平增加90倍。電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，凝血酶與FⅩA形成的纖維蛋白絲粗大緊密，而注射用血凝酶與巴曲酶形成的纖維蛋白絲纖細疏松，后者在纖維蛋白溶解實驗中很快被溶解。這說明注射用血凝酶由于只水解纖維蛋白原A肽，形成的止血塊很不牢固，易被水解清除［4］。這是臨床運用注射用血凝酶止血過程中不易發(fā)生血栓的一個主要原因。

6 注射用血凝酶對肝素抗凝血作用的影響

肝素是一種主要的抗凝血藥，起著抗凝血酶的輔因子作用。臨床上在經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(PTCA)或安置支架時常規(guī)給予肝素抗凝，但有引起出血的風險。低分子量肝素(LMWH)對凝血酶的抑制作用較弱，但保留了抗活化的因子Ⅹ的作用。我們研究了FⅩA是否有拮抗肝素的作用，選用0.000 1～0.005 U·mL-1不同濃度的FⅩA，但FⅩA僅在高濃度(0.000 5 U·mL-1)時有輕度中和作用，增加FⅩA深度不影響肝素的抗活化FⅩ的活性。這是由于肝素對凝血酶與因子Ⅹa等絲氨酸蛋白酶的抑制作用只起催化作用，抑制完成后可解脫下來，再催化下一個活化的凝血因子，肝素本身不被消耗。因此不管FⅩA的濃度是多少，都不能影響肝素的催化活性。同樣，不同濃度的FⅩA對LMWH的中和作用也不明顯;改用僅含有5個糖單位的磺達肝素鈉亦顯示類似的結果。但這些結果只說明FⅩA不拮抗肝素的抗凝作用，注射用血凝酶中最主要成分是巴曲酶，后者仍有可能減輕手術時運用肝素的出血風險。

7 注射用血凝酶及其有效成分對血小板聚集的影響

各種濃度的FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都不引起血小板聚集，對ADP、花生四烯酸與瑞斯托霉素等多種誘導劑引起的血小板聚集也無影響，因此注射用血凝酶及其有效成分不能直接活化血小板。

8 注射用血凝酶對臨床出血性疾病的止血作用

在體外實驗的基礎上，我們試用注射用血凝酶治療血友病A與先天性因子Ⅶ缺乏癥，實驗室檢查顯示凝血指標輕度改善，但出血未能控制。獲得性血友病A是一嚴重出血性疾病，由于患者體內(nèi)存在抗因子Ⅷ自身抗體，輸注因子Ⅷ無效。我們試用注射用血凝酶治療2例獲得性血友病A性疾病患者，實驗室檢查示aPTT輕度縮短，加用凝血酶原復合物以及免疫抑制劑等綜合治療后出血最后完全停止。初步結果表明，注射用血凝酶可做為獲得性血友病A的一種輔助治療藥物。但我們發(fā)現(xiàn)給與大劑量注射用血凝酶(8 U·d-1)并延長給藥時間(5 d)可能因纖維蛋白原過多降解會導致血漿纖維蛋白原水平的降低。

我們的研究工作證實了注射用血凝酶的止血效果，并首次觀察到注射用血凝酶可糾正多種出血性疾病的止血異常。這項研究表明:(1)注射用血凝酶體外局部止血有肯定的效果;(2)注射用血凝酶中的巴曲酶在止血中起了主要作用，F(xiàn)XA含量很低，只起次要作用;(3)注射用血凝酶引起的纖維蛋白凝塊易被分解，維持時間較短，因此常規(guī)劑量的注射用血凝酶無致血栓危險;但如連續(xù)大量給藥數(shù)天后可能使血漿纖維蛋白原降低;(4)注射用血凝酶可作為多數(shù)出血性疾病止血的輔助藥物，但不適用于無(低)纖維蛋白原血癥、DIC或纖維蛋白溶解亢進;(5)較長時間使用大劑量注射用血凝酶可能導致血漿纖維蛋白原水平，推薦在臨床上短期應用常規(guī)劑量。

［1］ de Paula EV，Kavakli K，Mahlangu J，et al.Recombinant factor VIIa analog(vatreptacog alfa［activated］)for treatment of joint bleeds in hemophilia patients with inhibitors:a randomized controlled trial［J］.J Thromb Haemost，2012，10(1):81.

［2］ 盧海武，林少芒，邵子力，等.巴曲亭——蛇毒凝血酶在普通外科手術中的應用研究［J］.血栓與止血學雜志，2003，9(1):18.

［3］ 韋 帆，廖 陽.血凝酶的臨床應用進展［J］.臨床合理用藥，2009，2(19):114.

［4］ Magalhaes HP，Magalhaes A，Juliano L，et al.Mechnism of action and detem-lination of the best substrate for a thrombin-like enzyme from Lacchesis muta muta venom by regression analysis of the kinetic parameters determined with peptidyl p-nitroanilide substrates［J］.Toxicon，2006，47(4):453.