組織培養(yǎng)技術(shù)在甜菜上的應(yīng)用及未來展望

吳則東 ，王華忠

（1.黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080）

植物組織培養(yǎng)是從20世紀(jì)30年代初期發(fā)展起來的一項(xiàng)生物技術(shù)。它是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞、胚胎以及原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽等，進(jìn)而培育成完整的植株[1]。Margara在1977年利用花芽和莖尖分生組織對甜菜首次成功進(jìn)行組織培養(yǎng)，1978年，Hussey和 Hepher[2]利用甜菜腋芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，成功產(chǎn)生小苗，自此以后，甜菜組織培養(yǎng)在很多個國家相繼展開，甜菜組織培養(yǎng)經(jīng)過了30多年的發(fā)展，取得了一些成績，例如利用未授粉胚珠培養(yǎng)單倍體、通過體細(xì)胞無性系變異產(chǎn)生新種質(zhì)以及通過細(xì)胞融合技術(shù)創(chuàng)造新材料等等，但是和其它作物相比，甜菜組織培養(yǎng)也存在很多不足。本文對組織培養(yǎng)技術(shù)在甜菜上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，對未來發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 組織培養(yǎng)技術(shù)在甜菜上的應(yīng)用

1.1 對某些甜菜品系進(jìn)行快速大量繁殖

對甜菜進(jìn)行快速繁殖是組織培養(yǎng)最基本的功能。甜菜快繁的對象一般包括以下幾個方面，一是剛剛發(fā)現(xiàn)的不育系，在未經(jīng)保持系保持的情況下，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快繁，以免材料丟失；二是新發(fā)現(xiàn)的、具有育種價值的稀少的野生材料，利用組織培養(yǎng)形成一定規(guī)模；三是對某些人工創(chuàng)制的稀有育種材料進(jìn)行大量擴(kuò)繁，形成品系；四是通過組織培養(yǎng)對轉(zhuǎn)基因甜菜材料進(jìn)行選擇和擴(kuò)繁。例如1992年，Goska等利用二倍體甜菜和三倍體甜菜雜交產(chǎn)生的9份甜菜三體材料，通過組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行擴(kuò)繁[3]。

1.2 創(chuàng)造甜菜新種質(zhì)

1.2.1 利用未授粉胚珠技術(shù)產(chǎn)生單倍體材料 甜菜屬于異花授粉作物，甜菜由于自交不親和，所以甜菜自交結(jié)實(shí)率非常低，很難產(chǎn)生純系，但是如果利用未授粉胚珠培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)單倍體，再利用秋水仙堿加倍形成二倍體，則即為二倍體純系。將此技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，即可大大加速育種的速度。一般說來，穩(wěn)定一個雜種后代需要12～13年的時間，有的需要更長，即便如此，有時候，后代還會出現(xiàn)變異，如中甜204的親本之一D8361，由原始材料到穩(wěn)定用了12年的時間；而甜研6號的親本穩(wěn)定用了將近16年的時間[4]。國外甜菜品種一般來說整齊度非常好，不論葉片還是根形差異不大；而國內(nèi)有些甜菜品種相比較而言則整齊度較差，葉片的形狀以及根形在一片地里很難保持完全的一致，而如果利用未授粉胚珠培養(yǎng)的技術(shù)，再通過染色體加倍，產(chǎn)生純合的授粉系材料。如果我們的不育系材料一致性非常地好，那么我們育成的品種就會有非常好的一致性，這將極其有利于品種的鑒別以及預(yù)防假冒種子。甜菜品種中甜花培1號就是利用未授粉胚珠培養(yǎng)選出的高糖、抗病品種，其中純合株系作為父本，四倍體材料為母本雜交而成，在4年內(nèi)就創(chuàng)制出用于育種的新材料，提高了育種效率、縮短了育種周期[5]。

1.2.2 利用體細(xì)胞無性系變異產(chǎn)生抗性材料 植物組織培養(yǎng)所形成的愈傷組織或再生植株是由親本植物細(xì)胞經(jīng)有絲分裂和分化而產(chǎn)生的，其遺傳組成似乎應(yīng)當(dāng)與原始親本一致。但事實(shí)上無論有無誘變劑的存在，在再生植株中都存在著大量的遺傳變異，這種變異稱為“體細(xì)胞無性系變異”[6]。1990年，F(xiàn)reytag等人利用甜菜葉柄進(jìn)行組織培養(yǎng)，采用了5個不同濃度的鹽梯度，選擇耐鹽品系，然后將再生植株種植在包含鹽濃度為0.1%的土壤中，從形態(tài)學(xué)上觀察，發(fā)現(xiàn)和種植在無鹽的土壤中沒有什么差異，說明產(chǎn)生了耐鹽的突變細(xì)胞[7]。馬龍彪等人利用甜菜褐斑病菌毒素作為選擇壓力，設(shè)置不同的濃度梯度，對甜菜未授粉胚珠的抗性愈傷組織以選擇壓力，然后誘導(dǎo)產(chǎn)生植株，最后經(jīng)過田間試驗(yàn)進(jìn)行抗病性鑒定，證明經(jīng)過選擇壓力存活的甜菜植株極大地增加了抗褐斑病的能力[8]。王紅旗等利用甲基硫酸乙酯或紫外線對甜菜未授粉胚珠的愈傷組織進(jìn)行誘變處理，然后利用褐斑病菌株施加選擇壓力，經(jīng)擴(kuò)繁、壯苗、生根后，進(jìn)行移栽、鏡檢、加倍成苗后，在田間進(jìn)行抗褐斑病試驗(yàn)，結(jié)果表明比對照種感病率輕1.5級以上[9]。Saunders將沒有突變的懸浮細(xì)胞暴露在2.8nM的氯磺隆中，最終獲得了一個含有顯性單基因的抗磺酰脲類除草劑的品系[10]。

1.2.3 利用體細(xì)胞雜交技術(shù)創(chuàng)造新物種 體細(xì)胞雜交 （Somatic hybridization）即原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion），是生物技術(shù)中重要的領(lǐng)域之一，在植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良中發(fā)揮了獨(dú)特的作用，并獲得了一些新種質(zhì)。它是指雙親的原生質(zhì)體（可以是種間、屬間、甚至科間）在特定的物理或化學(xué)因素作用下誘導(dǎo)融合成雜種細(xì)胞（核質(zhì)雜種或胞質(zhì)雜種），通過細(xì)胞分裂形成愈傷組織，并分化和再生出植株[11]。從中選優(yōu)去劣，按育種目標(biāo)要求培育出新品種，并創(chuàng)造出新物種。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的變異通?？梢酝ㄟ^表型的變化觀察到，有的則需要通過同工酶或者分子標(biāo)記手段，例如RFLP及RAPD來加以分析[12]。但是甜菜的體細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展相對較慢，目前通過體細(xì)胞雜交創(chuàng)造甜菜新種質(zhì)的報道較少，楊愛芳等[13]用PEG介導(dǎo)的方法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，從S10×7721及甜研302×7721的融合細(xì)胞獲得了愈傷組織及胚狀體。進(jìn)一步通過染色體分析及同工酶譜分析確定了體細(xì)胞雜種植株，同時鑒定出一批如甜研302和S10的同源多倍體。

1.3 組織培養(yǎng)是開展基因工程必不可少的輔助手段

目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展得很快，例如甜菜也成功地轉(zhuǎn)入了抗除草劑基因以及抗真菌病的幾丁質(zhì)酶基因等等[14]，而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入抗除草劑基因的甜菜品種已經(jīng)應(yīng)用在生產(chǎn)上超過了10年，為農(nóng)民節(jié)省了大量的人力。但無論利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電穿孔法還是微注射法，都要以組織培養(yǎng)技術(shù)作為依托。

1.4 保存甜菜種質(zhì)

一般說來，甜菜是以種子的形式進(jìn)行保存，育種家都會把自己掌握的資源在常溫條件下進(jìn)行保存，并且每隔幾年進(jìn)行1次繁殖，以防止種子發(fā)芽率降低。另外國家也有專門的中長期種子庫，對種子進(jìn)行低溫保存。但是由于種質(zhì)資源要經(jīng)常進(jìn)行繁殖，繁殖的過程不但要消耗很多的人力、物力，還可能會因?yàn)槿藶榈腻e誤造成混種，如不育系和保持系栽植距離過近，則極可能造成不育系中混入保持系，而造成不育系難以淘汰。另外對于某些難以用種子進(jìn)行保存的資源或者某些稀缺資源，可以考慮用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行種質(zhì)保存。如新發(fā)現(xiàn)的不育系突變體、野生資源等等。同時，離體保存的材料不受各種病蟲害侵染、不受季節(jié)限制，利于種質(zhì)資源地區(qū)間及國際間的交換和轉(zhuǎn)移，給保存和搶救有用基因帶來了希望[1]。組織培養(yǎng)保存種質(zhì)一般是在超低溫條件（一般指液氮低溫，-196℃）下，幾乎所有的細(xì)胞代謝活動和生長過程都停止進(jìn)行，可以最大化、長期穩(wěn)定地保存種質(zhì)的基因型和表現(xiàn)型，并且占用最小的保存空間[15]。1982年，Miedema P對甜菜的不育系，二倍體及四倍體授粉系在5℃條件下進(jìn)行組培保存，但是這種保存不但費(fèi)時、費(fèi)力，而且容易造成某些基因型的丟失[16]。甜菜的低溫保存一般選取莖尖或者根尖，采用三碘苯甲酸或者二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑[17-18]。甜菜玻璃化超低溫保存技術(shù)一般要經(jīng)過幾個步驟，第一天進(jìn)行預(yù)處理，再經(jīng)過3d預(yù)培養(yǎng)和7h的脫水處理，但是這種復(fù)雜的程序已經(jīng)進(jìn)行了簡化，現(xiàn)在只需要在含有0.3M的蔗糖培養(yǎng)基中5℃預(yù)處理1d，然后在20℃條件下用2M甘油和0.4 M蔗糖處理20min，在放入液氮之前，在0℃下脫水20min，解凍后組培成活率可以達(dá)到60%～100%[17]。

2 甜菜組織培養(yǎng)技術(shù)未來發(fā)展展望

甜菜組織培養(yǎng)技術(shù)從發(fā)展到現(xiàn)在雖然取得了一些成績，如繁殖幼苗、未授粉胚珠培養(yǎng)等等，但是和其它作物相比，甜菜組織培養(yǎng)還有很多方面有待研究，還有很多工作需要努力，主要有以下幾個方面。

2.1 進(jìn)一步探索甜菜未授粉胚珠成活的限制條件

雖然甜菜未授粉胚珠培養(yǎng)已經(jīng)取得了成功，并且成功地育成了品種，但是成活率受到甜菜基因型的影響很大，目前很多作物都已經(jīng)建立了自己的DH（雙單倍體）群體，用于開展遺傳圖譜和QTL定位的研究，但是由于甜菜未授粉胚珠成活率較低，平均只有10%左右，很難建成DH群體。因此今后有必要積極探索制約未授粉胚珠成活的因素。

2.2 利用體細(xì)胞雜交技術(shù)創(chuàng)造新種質(zhì)

我國甜菜種質(zhì)資源極其匱乏，而利用體細(xì)胞雜交則是創(chuàng)造種質(zhì)資源的很好辦法，但是由于我國在原生質(zhì)體培養(yǎng)方面的技術(shù)還有待提高，因此體細(xì)胞雜交技術(shù)應(yīng)用緩慢，這方面的報道也較少。因此甜菜原生質(zhì)體成苗率將成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

2.3 繼續(xù)探討研究低溫保存甜菜種質(zhì)的方法

國外對于低溫保存甜菜種質(zhì)研究的報告比較多，也取得了一定的進(jìn)展，而國內(nèi)在這方面還沒有開展相關(guān)的研究，因此，國內(nèi)也要積極開展低溫玻璃化保存甜菜的機(jī)理以及更加優(yōu)化的方法。

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