甜葉菊組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

周玉麗 ，崔廣榮 ，張子學(xué) ，胡能兵 ，何克勤 ，林 平 ，舒英杰

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230000；2.安徽科技學(xué)院，鳳陽 233100）

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）又名“甜菊”、“甜草”，菊科甜葉菊屬，原產(chǎn)南美洲巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脈[1]。1976年南京中山植物園從日本引種甜葉菊試驗(yàn)成功后，20世紀(jì)80年代初全國各地開始種植，目前我國是世界上甜葉菊種植面積最大的國家，在江蘇、福建、廣東、浙江、山東、河南、安徽、新疆等地均有大面積種植，總植面積超過6萬hm2[2]。

甜葉菊是理想的甜味劑，其葉片富含甜葉菊糖苷，因其具有甜度高（甜度是蔗糖的350～400倍）、熱量低（熱量約為蔗糖的1/300）、安全無毒等特點(diǎn)[3－4]，加之甜葉菊糖苷有控制血糖、降低血壓、促進(jìn)新陳代謝的作用，亦有治療糖尿病、肥胖癥、調(diào)節(jié)胃酸、恢復(fù)神經(jīng)疲勞之功效[5－6]，甜葉菊深受肥胖癥患者和糖尿病人的青睞。另外，甜葉菊可增進(jìn)家畜、賽馬和寵物的食欲并能治療它們的慢性疾病及牛的不孕癥，已引起國外畜牧和飼料工作者的關(guān)注[7]。在日本和巴西，甜葉菊糖苷已成為蔗糖的替代品被廣泛應(yīng)用，在南美、東南亞、遠(yuǎn)東地區(qū)，甜葉菊糖苷已被廣泛應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域[8]，在國際上被譽(yù)為“世界第三健康糖源”[9]。我國衛(wèi)生部于1985年和1990年分別批準(zhǔn)了甜葉菊糖苷為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料[10]。因此，甜葉菊逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

由于種子極?。ㄇЯＶ丶s0.02g），甜葉菊不利于實(shí)生繁殖；甜葉菊為異花授粉植物，不利于雜交種的純合及品種的防雜保純，因此，甜葉菊的組培快繁成為了甜葉菊工廠化育苗的主要措施。20世紀(jì)七、八十年代，中國科學(xué)院植物研究所、復(fù)旦大學(xué)和中國科學(xué)院武漢植物研究所在我國較早地開展了甜葉菊組織培養(yǎng)研究。目前，人們對甜葉菊的無菌繁殖體系、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的選擇、愈傷組織的誘導(dǎo)與分化、芽分化和繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及組培苗的移栽等方面作了較為全面、系統(tǒng)的研究。

1 甜葉菊無菌繁殖體系建立的研究

1.1 外植體的選擇與消毒

外植體的選擇是植物離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，到目前為止人們已成功利用甜葉菊種子[11]、莖尖[12]、葉片[13-14]、葉柄[15-16]和莖段[17]等獲得了再生植株，其中莖尖是甜葉菊組織培養(yǎng)最理想的外植體材料[18-19]。甜葉菊最適外植體的選擇，應(yīng)依不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ魹榱双@取愈傷組織，葉片、莖節(jié)和莖段是較為理想的外植體材料[21-23]；但若要繁殖大量試管苗，莖尖則是最為理想的材料[18]。

植物組織培養(yǎng)中，外植體滅菌、消毒劑種類及消毒時(shí)間對外植體存活率都有明顯影響，消毒時(shí)間過長可能引起外植體褐變而降低存活率，過短則達(dá)不到消毒目的。甜葉菊外植體常用的消毒劑為75%酒精和0.1%HgCl2，一般將70%～75%酒精和0.1%HgCl2配合使用。徐慧珠等[13]取當(dāng)年生或宿根植株上已展開的幼葉，洗凈后用0.1%HgCl2消毒3～5min，用無菌水沖洗4～5次，然后用整葉或?qū)⑷~剪成0.25cm2大小接種于固體培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)分化出完整甜葉菊植株。黃蘇珍等[16]將甜葉菊頂芽和葉柄，先用自來水沖洗凈，再用10%的洗衣粉溶液浸泡5min后，經(jīng)70%的酒精表面消毒2min，用0.1%的HgCl2溶液消毒5min，然后用無菌水沖洗3～5次，消毒效果較好。沈秀麗等[15]將甜葉菊種子在70%酒精浸20s，再放入0.1%HgCl210min，然后用無菌水沖洗干凈，培養(yǎng)獲得了無菌植株。崔廣榮等[23]研究表明，70%酒精處理15～30s+0.1%HgCl2處理4min較為適合甜葉菊莖段外植體滅菌。

1.2 基本培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的選擇

甜葉菊組織培養(yǎng)目前主要采用MS，1/2MS，1/4MS為基本培養(yǎng)基，愈傷組織及繼代增殖主要用MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)主要用1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基。但也有用B5[24]、White[14]、H[13]和N6[25]為基本培養(yǎng)基獲得試管苗的報(bào)道。沈秀麗等[25]研究表明，選用MS為基本培養(yǎng)基，比以N6、B5為基本培養(yǎng)基的愈傷組織形成及出芽率都高。在碳源的選擇上，以3%蔗糖效果最好，以葡萄糖、麥芽糖作碳源，無論是愈傷組織形成，還是出芽率都較低。Dhir等[26]研究了蔗糖、葡萄糖和麥芽糖對莖尖及腋芽誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果表明蔗糖和葡萄糖相對較適不定芽的誘導(dǎo)。Bondarev等[27]的研究表明，在附加果糖或葡萄糖的MS培養(yǎng)基中甜葉菊芽的生長發(fā)育情況要優(yōu)于添加蔗糖的培養(yǎng)基。

植物組織培養(yǎng)中外界環(huán)境條件是一個(gè)較為重要的因素，主要包括光照、溫度、濕度、培養(yǎng)基酸堿度和氣體成分等方面。研究表明，甜葉菊組織培養(yǎng)較為理想的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基pH值5.5～6.0、光照強(qiáng)度1500～3000lx、光照時(shí)間 12h～14h/d、RH 60%～70%、培養(yǎng)溫度 23～28℃[11，18，21～22，28]。

2 甜葉菊愈傷組織的誘導(dǎo)與分化研究

植物各種器官的外植體在離體條件下，細(xì)胞經(jīng)過脫分化等一系列過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榉只?xì)胞，繼而轉(zhuǎn)變成一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán)，成為愈傷組織，植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織成敗的重要因素。許多研究表明，BA、6-BA和NAA是誘導(dǎo)愈傷組織的主要植物生長調(diào)節(jié)劑，但不同研究者、不同品種和不同材料的結(jié)論不同。王凱基等[29]研究表明，生長素種類對誘發(fā)甜葉菊愈傷組織影響不大，而對愈傷組織的形態(tài)起著不同的調(diào)節(jié)作用。臧淑英等[30]研究表明，單獨(dú)添加NAA 0.5mg/L或2，4-D 0.2mg/L的MS培養(yǎng)基對甜葉菊離體莖段愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為88%和76%，基本培養(yǎng)基中不補(bǔ)加任何激素或單加一種細(xì)胞分裂素，都不能誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生愈傷組織。倪德祥等[31]研究表明，甜葉菊葉片和莖段分別接種在附加不同濃度NAA和BA的培養(yǎng)基后，葉與莖愈傷組織和器官發(fā)生的潛力不同，葉片培養(yǎng)可誘導(dǎo)發(fā)生芽和根，而莖段培養(yǎng)只能誘發(fā)根，高濃度的 NAA 有利于促進(jìn)愈傷組織生長；MS+BA（2～10mg/L）+NAA（0～2mg/L）的培養(yǎng)基有利芽發(fā)生，MS+BA（0～0.2mg/L）+NAA（2～10mg/L）有利誘導(dǎo)發(fā)根。Ferreira等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在添加 BA 0.5mg/L 和 2，4-D 1.0mg/L 的 LS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行甜葉菊細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，每隔6～7d繼代培養(yǎng)1次，20～30d后可獲得愈傷組織。陳少瑜等[33]以葉片為外植體，在MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.2mg/L+BA 0.5mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出黃色疏松型愈傷組織，而在MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了綠色堅(jiān)硬的愈傷組織。沈秀麗等[25]研究表明，用MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的培養(yǎng)基，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)83%。葉軍等[34]取甜葉菊無菌苗的幼苗葉片，分別接種于MS+6-BAP 1～3 mg/L+NAA 2 mg/L的培養(yǎng)基中獲得了愈傷組織。婁玉霞等[14]以甜葉菊葉片為外植體，在附加300mg/L水解酪蛋白MS基本培養(yǎng)基上，離體葉片在BA和NAA均為0.5mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，BA 0.5mg/L和NAA 0.05mg/L的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)愈傷組織100%分化不定芽。Tadhani等[35]在MS培養(yǎng)基上添加NAA 2.0 mg/L和6-BA 0.3mg/L的也可誘導(dǎo)出了大量愈傷組織。Banerjee等[36]利用添加不同藍(lán)藻混合物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片愈傷組織的形成，藍(lán)藻的最佳添加量為5mL/L和10mL/L。

3 甜葉菊芽分化和繼代增殖培養(yǎng)研究

根據(jù)外植體分化和生長的方式不同，繼代培養(yǎng)中培養(yǎng)物的增殖方式也各不相同，就目前而言，甜葉菊的繼代增殖方式主要有3種：多節(jié)莖段增殖、叢生芽增殖和不定芽增殖。徐惠珠等[13]把愈傷組織轉(zhuǎn)移到細(xì)胞分裂素和生長素比例為0.65∶1～10∶1的分化培養(yǎng)基上后，發(fā)現(xiàn)愈傷組織結(jié)構(gòu)日趨致密，顏色逐漸變綠，40～60d后即可分化出芽。Tamura等[37]以帶葉原基的莖尖為外植體，在添加KT 10mg/L的基本培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)出了大量叢生芽。Lee等[38]認(rèn)為，在以MS為基本培養(yǎng)基，附加NAA 0.1 mg/L時(shí)，添加KT比添加BA更有利于甜葉菊莖尖的增殖。黃蘇珍等[16]在“中山一號”甜葉菊快繁中發(fā)現(xiàn)，在MS附加ZT 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L的培養(yǎng)基上，每3～4周可增殖5～6倍。Mitra等[39]在添加KT 10 mg/L，IAA 1.0 mg/L和AdS 30 mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽的分化，4周內(nèi)出芽率達(dá)90%。張子學(xué)等[40]研究表明，適宜甜葉菊增殖的培養(yǎng)基為MS+BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L，最高增殖倍數(shù)達(dá)14.4倍。董振紅等[28]采用甜葉菊的幼嫩莖尖為外植體，在MS基本培養(yǎng)基添加6-BA 1.0mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，不感染病菌的情況下，誘導(dǎo)出芽率可達(dá)100%；繼代增殖培養(yǎng)基采用MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6g/L，繼代培養(yǎng)30d后，叢生芽數(shù)可增殖14～15倍。Jain等[41]在添加BAP 2.2μM和IAA 2.8μM的MS培養(yǎng)基上以葉片和莖段為外植體，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生了不定芽。袁學(xué)軍等[11]研究表明，以甜葉菊種子為外植體，認(rèn)為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L最適于叢生芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為98.6%。崔廣榮等[23]研究表明，MS培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L適合試管苗增殖，增殖系數(shù)可達(dá)7.4。

4 甜葉菊組培苗生根培養(yǎng)研究

組培苗生根有兩種方式，一種是試管內(nèi)生根，一種是試管外生根。目前有關(guān)甜葉菊試管內(nèi)生根的報(bào)道較多，甜葉菊組培苗生根培養(yǎng)以MS、1/2MS和1/4MS為主，同時(shí)添加不同濃度的NAA、IBA或二者組合。甜葉菊在試管中生根效果較好，黃蘇珍等[16]研究表明，甜葉菊“中山一號”品系以MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L生根效果最好，ZT抑制根的發(fā)生。婁玉霞等[14]以離體葉片誘導(dǎo)形成愈傷組織并誘導(dǎo)分化不定芽，不定芽在附加NAA 0.01mg/L的White基本培養(yǎng)上誘導(dǎo)生根，生根率可達(dá)100%。Sivaram等[42]認(rèn)為，添加IBA 4.9μM的1/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽生根效果要好于添加同樣濃度IBA的MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)30d后能夠誘導(dǎo)出12～13條長且濃密的根，生根率達(dá)100%。Bondarev等[27]則認(rèn)為，NAA對甜葉菊根的形成無影響，而BA則強(qiáng)烈地抑制根系統(tǒng)的形成，但當(dāng)添加赤霉素時(shí)，會有利于芽的伸長及根的誘導(dǎo)。Dhir等[26]將長至3～5cm的不定芽轉(zhuǎn)入附加IAA或IBA（1～4mg/L）的生根培養(yǎng)基中，移栽后成活率在95%以上。張子學(xué)等[40]研究表明，適宜甜葉菊生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.25mg/L，生根率達(dá)85.7%。董振紅等[28]在MS＋I(xiàn)BA 0.1mg/L＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6g/L＋活性炭1g/L的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)100%。崔廣榮等[23]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基添加0.0～0.5 mg/L的IBA或NAA均適合甜葉菊試管苗生根。甜葉菊試管外生根也是一種降低生產(chǎn)成本的有效措施，不僅可以減少無菌操作的工時(shí)消耗，而且減少了培養(yǎng)基制備材料與能源消耗。崔廣榮等[43]采用甜葉菊組培苗扦插的方法實(shí)現(xiàn)了組培苗的試管外生根，栽插成活率達(dá)99%。

5 甜葉菊組培苗移栽研究

離體繁殖的組培苗能否大量應(yīng)用于生產(chǎn)，是否有效益，關(guān)鍵是看組培苗能否有較高的移栽成活率。目前對甜葉菊組培苗移栽的報(bào)道不多，主要是關(guān)于移栽前的處理、移栽溫度和濕度方面的研究。翁曉燕等[44]研究證明，2.5～10mg/L濃度的多效唑能有效提高甜葉菊試管苗移栽后的成活率，處理根系比葉面噴施效果更好，其中以5mg/L濃度在開蓋煉苗浸根3d處理最為有效，移栽成活率達(dá)到92.4%，是對照的2.26倍。黃蘇珍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，甜葉菊組培苗出瓶后還須注意保濕和遮蔭，使其逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，提高出瓶的成活率。董振紅等[28]研究指出試管苗長至5～7cm時(shí)，組培苗出瓶前先敞口煉苗2d，生根苗移栽后成活率可達(dá)95%以上。

6 甜葉菊組織培養(yǎng)研究展望

國內(nèi)外有關(guān)甜葉菊組織培養(yǎng)方面的研究已開展了30多年，無論在理論上還是技術(shù)上都取得了長足發(fā)展。目前人們已經(jīng)初步建立了甜葉菊的快繁體系，但不同植物種類、同一物種的不同品種間（基因型不同）、同一植物的不同組織器官以及不同的培養(yǎng)階段所需的植物生長調(diào)節(jié)劑均可能有所不同。如目前尚未見關(guān)于糖苷含量高及抗逆性強(qiáng)的甜葉菊品種的組培快繁體系建立的報(bào)道，因此，摸索不同甜葉菊品種（系）或不同組織器官以及不同培養(yǎng)階段的快繁體系仍然還有很多工作要做。今后，應(yīng)在不斷完善不同甜葉菊品種的快繁技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，將甜葉菊組織培養(yǎng)與種質(zhì)資源、優(yōu)良品種選育以及基因工程等生物技術(shù)聯(lián)系起來，如將甜葉菊組織培養(yǎng)應(yīng)用于種質(zhì)資源的離體保、轉(zhuǎn)基因、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交等。另外，為了實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，應(yīng)加強(qiáng)甜葉菊的工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)以及相關(guān)的組培苗移栽方面的研究。

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