結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗抗結(jié)核作用的研究

梁艷 吳雪瓊 張俊仙 白雪娟 陽(yáng)幼榮 李寧 余琦 李忠明 王蘭 史迎昌

結(jié)核病是一種慢性呼吸道傳染病，合理、規(guī)律的化療一般在1～2個(gè)月內(nèi)即可殺死病灶內(nèi)絕大多數(shù)Mtb，但仍有少量菌殘留，尤其是寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb不易被殺死，需繼續(xù)治療3～4個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。由于耐多藥結(jié)核病的流行、化療藥物的不良反應(yīng)，以及人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染、免疫抑制劑的使用和老年性結(jié)核病等原因引起的機(jī)體免疫功能低下，使難治性結(jié)核病增多，抗結(jié)核治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是耐多藥結(jié)核?。∕DR－TB）、廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR－TB）面臨無(wú)藥可治的困難局面。因此，研制新的抗結(jié)核制劑及新的有效、價(jià)廉的治療方案勢(shì)在必行。

抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，體液免疫是否起作用尚有爭(zhēng)議，機(jī)體的免疫狀態(tài)與結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。治療性疫苗的應(yīng)用對(duì)象與預(yù)防性疫苗不同，前者用于Mtb感染者或結(jié)核病患者，而后者用于正常人群。免疫治療可以通過(guò)調(diào)節(jié)或選擇性地誘導(dǎo)結(jié)核病患者免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏的潛力，來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。在抗結(jié)核化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合免疫治療有可能縮短療程，實(shí)現(xiàn)“超短程化療”。近年來(lái)通過(guò)免疫調(diào)節(jié)輔助治療結(jié)核病成為研究的熱點(diǎn)之一，免疫治療制劑的研究與開(kāi)發(fā)成為一個(gè)十分重要的研究方向。死疫苗（如微卡菌苗和烏體林斯）只能誘導(dǎo)體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，不能誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）應(yīng)答；而DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原，不僅能誘導(dǎo)體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答，這對(duì)于殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生的分枝桿菌更有意義。因此，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所和上海海規(guī)生物科技有限公司聯(lián)合研制了Mtb Ag85A DNA疫苗，并在國(guó)內(nèi)外首先將其用于結(jié)核病治療研究［1］。筆者簡(jiǎn)要地概述本課題組 Mtb Ag85A DNA疫苗抗結(jié)核作用的研究情況。

一、免疫原性的研究

1.小鼠血清中抗Ag85A蛋白抗體水平：小鼠免疫前、第1次至第3次免疫后10 d取血清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組抗Ag85A抗體，以各組小鼠免疫前抗體水平為對(duì)照，計(jì)算生理鹽水組、p VAX1載體組、微卡菌苗組和Ag85A DNA疫苗組小鼠第1次至第3次免疫后抗體升高水平。

生理鹽水組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體水平均無(wú)顯著增高（P＞0.05）。p VAX1載體組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體均極顯著增高（P＜0.01），于第2次免疫后達(dá)到高峰，證明p VAX1載體具有一定的非特異免疫增強(qiáng)作用。微卡菌苗組在第1次免疫后，抗Ag85A抗體極顯著增高（P＜0.01）；第2次、第3次免疫后，抗Ag85A抗體也顯著增高（P＜0.05）；于第3次免疫后達(dá)到高峰，表明微卡菌苗具有非特異免疫增強(qiáng)作用。Ag85A DNA疫苗組在第1次至第3次免疫后，抗Ag85A抗體均極顯著增高（P＜0.01），于第2次免疫后達(dá)到高峰，抗體升高水平均顯著高于對(duì)照組，證明Ag85A DNA疫苗可刺激小鼠特異的體液免疫功能。

2.小鼠第3次免疫后分泌γ干擾素的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)［2］：小鼠第3次免疫后14 d殺鼠取血抗凝，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）方法檢測(cè)各組分泌γ干擾素的T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)，以各組小鼠空白對(duì)照孔為對(duì)照，計(jì)算各組小鼠檢測(cè)孔的細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)。

生理鹽水組未見(jiàn)Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細(xì)胞；p VAX1載體組和微卡菌苗組均可見(jiàn)少量Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細(xì)胞；而Ag85A DNA疫苗組可見(jiàn)大量Ag85A特異的分泌γ干擾素的T淋巴細(xì)胞。結(jié)果表明Ag85A DNA疫苗顯著增強(qiáng)了小鼠特異的細(xì)胞免疫功能。

3.小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素和白細(xì)胞介素－4的水平［2］：小鼠第3次免疫后14 d殺死小鼠，取脾臟，研磨后分離脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)抗原刺激后，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組分泌的γ干擾素和白細(xì)胞介素－4，計(jì)算各組小鼠檢測(cè)孔的細(xì)胞因子分泌量。

Ag85A DNA疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素的水平明顯高于生理鹽水組、p VAX1載體組和微卡菌苗組，而分泌白介素－4的水平明顯減少。結(jié)果表明Ag85A DNA疫苗主要刺激Th1型的免疫反應(yīng)。

4.Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和 Ag85B 4種 DNA疫苗免疫原性的比較：（1）雌性BALB/c小鼠結(jié)核感染8周、第1次至第4次免疫治療后2周及免疫治療5個(gè)月時(shí)，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組抗結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白64（Mycobacterium tuberculosis secreted protein 64，MPT64）或早期分泌抗原靶6 （early secretory antigenic target 6，ESAT6）或Ag85A抗體。通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察DNA疫苗組小鼠抗特異性抗原抗體的變化，發(fā)現(xiàn)一般在第2次免疫治療后，抗體才開(kāi)始升高，第3、4次達(dá)到高峰，停止治療3個(gè)月后抗體已開(kāi)始下降或明顯下降，說(shuō)明 MPT64、ESAT6、Ag85A DNA疫苗肌內(nèi)注射后確實(shí)能在機(jī)體內(nèi)表達(dá)蛋白，但DNA疫苗激活B細(xì)胞的反應(yīng)較滯后，可能是因?yàn)榭贵w的產(chǎn)生有賴于完整抗原被B細(xì)胞識(shí)別。其中MPT64 DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平最高，其次是ESAT6 DNA疫苗，Ag85A DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平較低，可能是因?yàn)镋SAT6和Ag85A是T細(xì)胞抗原，主要刺激T淋巴細(xì)胞，而MPT64既是T細(xì)胞又是B細(xì)胞抗原；也可能是MPT64在體內(nèi)表達(dá)量較高，而其他2種質(zhì)粒DNA表達(dá)量較低所致。上述3種抗體均以IgG2a和IgG1為主，IgG2a均顯著高于IgG1，說(shuō)明主要誘導(dǎo)Th1型免疫功能。這3種質(zhì)粒DNA都能較好地刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，使脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著增高［3］。（2）通過(guò)ELISA方法檢測(cè)雌性C57BL/6小鼠第3次DNA免疫后第12 d血清中抗MPT64、ESAT6、Ag85A 和 Ag85B抗 體IgG 及 其 亞 型IgG1、IgG2a和IgG2b。結(jié)果顯示 MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B DNA免疫后均可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。但MPT64或ESAT6與IL－12或γ干擾素質(zhì)粒DNA共同免疫小鼠后，抗MPT64或ESAT6抗體水平無(wú)顯著升高，與對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DNA疫苗與細(xì)胞因子共同免疫后，細(xì)胞因子可減少小鼠對(duì)DNA疫苗的抗原特異性抗體反應(yīng)，主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫功能［4］。此外，上述4種抗體亞型IgG2a均無(wú)顯著升高，IgG2b均顯著高于IgG1，表明C57BL/6小鼠主要是IgG2b升高為主，與BALB/C小鼠主要以IgG2a升高為主不同。但無(wú)論是IgG2a還是IgG2b占優(yōu)勢(shì)都說(shuō)明是誘導(dǎo)Th1型免疫功能為主，而結(jié)核的保護(hù)性免疫恰恰與一個(gè)強(qiáng)的Th1型T細(xì)胞反應(yīng)的建立有關(guān)。

鑒于Ag85A DNA疫苗以誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)為主；免疫治療2個(gè)月時(shí)，肺菌落數(shù)減少較其他DNA疫苗顯著，因此，選擇Ag85A DNA疫苗治療小鼠結(jié)核病模型1～2個(gè)月進(jìn)一步研究。

二、Mtb Ag85A DNA疫苗治療抗結(jié)核藥物敏感的結(jié)核病的療效

用Mtb H37Rv通過(guò)尾靜脈注射50只BALB/c小鼠，分別用生理鹽水、p VAX1載體、利福平（RFP）、草分枝桿菌菌苗和Ag85A DNA疫苗治療。免疫治療3次后，與生理鹽水對(duì)照組比較，p VAX1載體組肺菌落數(shù)顯著高于生理鹽水組（P＜0.05），肝臟菌落數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；RFP治療組、草分枝桿菌菌苗治療組和Ag85A DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；RFP組肺和肝臟菌落數(shù)均比草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組顯著減少（P＜0.001）；草分枝桿菌菌苗組和 Ag85A DNA疫苗組的肺和肝臟菌落數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

免疫治療5次后，與生理鹽水對(duì)照組比較，p VAX1載體組肺和肝臟菌落數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；RFP治療組、草分枝桿菌菌苗治療組和Ag85A DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數(shù)均非常顯著地減少（P＜0.001或P＜0.01）；RFP組肺和肝臟菌落數(shù)均比草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組顯著減少（P＜0.001）；草分枝桿菌菌苗組和Ag85A DNA疫苗組的肺和肝臟菌落數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從小鼠肺、肝菌落計(jì)數(shù)來(lái)看，與對(duì)照組相比，各治療組均有一定的治療作用，免疫5次和免疫3次，Ag85A DNA疫苗的治療效果相似，但免疫5次的效果較3次時(shí)明顯；Ag85A DNA疫苗的免疫治療效果與草分枝桿菌菌苗相當(dāng)。

三、Mtb Ag85A DNA疫苗聯(lián)合化學(xué)藥物治療耐多藥結(jié)核病的療效研究

DNA疫苗每隔2周免疫1次，共免疫5次。

1.第一次研究：（1）肺組織病理學(xué)檢查［5］：肺組織用10%的多聚甲醛固定后包埋在石蠟中切片。組織切片用蘇木精和曙紅試劑染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察分析結(jié)果。生理鹽水組、p VAX1載體治療組肺組織病變廣泛，未見(jiàn)或少見(jiàn)增殖性結(jié)節(jié)；RFP治療組、RFP加Ag85A DNA疫苗治療組、Ag85A DNA疫苗治療組、RFP加 Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、微卡菌苗治療組肺組織病變均較輕，病變范圍局限，可見(jiàn)較多的結(jié)核結(jié)節(jié)，主要呈增殖性改變。（2）肺、脾懸液涂片抗酸染色［6］：各對(duì)照組和RFP對(duì)照組肺Mtb較粗大，而各疫苗治療組肺部分 Mtb變細(xì)而短。（3）肺和脾菌落計(jì)數(shù)［5］：各疫苗治療組肺脾菌落計(jì)數(shù)均比對(duì)照組和RFP治療組減少2～5倍。與生理鹽水對(duì)照組比較，p VAX1載體組和RFP治療組的肺和脾臟菌落數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；微卡菌苗治療組、HSP65 DNA疫苗、Ag85A DNA疫苗和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組的肺和肝臟菌落數(shù)均顯著減少（P＜0.05或P＜0.001）；Ag85A DNA疫苗單獨(dú)治療或聯(lián)合RFP治療小鼠耐多藥結(jié)核病模型的肺和脾臟菌落數(shù)均少于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組和HSP65 DNA疫苗治療組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。

2.第二次研究［2］：（1）各組小鼠死亡情況：p VAXI載體組、RFP治療組、微卡菌苗治療組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組、RFP加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組小鼠死亡率分別是10%、10%、10%、100%、20%，吡嗪酰胺（PZA）治療組、Ag85A DNA疫苗治療組、RFP加Ag85A DNA疫苗治療組、PZA加Ag85A DNA疫苗治療組和PZA加Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療組小鼠均存活。（2）肺臟組織病理改變：治療結(jié)束后4周，p VAX1載體組和RFP組肺組織病變嚴(yán)重、廣泛，實(shí)變，肺泡壁重度腫脹、增厚，正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。PZA組小鼠肺組織病變比p VAX1載體組和RFP組略輕，肺泡壁中度和重度增厚，1/5區(qū)域可見(jiàn)正常的肺泡結(jié)構(gòu)，病變區(qū)域可見(jiàn)多核巨細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞和中等量淋巴細(xì)胞。Ag85A DNA疫苗組、Ag85A DNA疫苗聯(lián)合RFP組、Ag85A DNA疫苗聯(lián)合PZA組小鼠肺組織病變比PZA組輕，病灶局限，1/2區(qū)域可見(jiàn)正常的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡輪廓相對(duì)清晰，病變區(qū)域可見(jiàn)多核巨細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞。Ag85A/ESAT6嵌合DNA聯(lián)合RFP組、Ag85A/ESAT6嵌合DNA聯(lián)合PZA組小鼠肺組織病變比PZA組輕，病灶局限，但治療效果不如Ag85A DNA疫苗單獨(dú)治療組或聯(lián)合藥物治療組。（3）肺、脾活菌計(jì)數(shù)：與對(duì)照組相比，Ag85A DNA疫苗單獨(dú)治療或與RFP、PZA聯(lián)合治療的肺和脾菌落數(shù)分別減少了1.0～1.38 logs。上述2次研究結(jié)果顯示，應(yīng)用HSP65、Ag85A和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗治療耐多藥結(jié)核病的小鼠，并以微卡菌苗、RFP、PZA、質(zhì)粒載體和生理鹽水為對(duì)照，免疫治療2個(gè)月后，RFP單獨(dú)治療耐多藥結(jié)核病無(wú)效，而PZA治療有效，說(shuō)明成功地建立了小鼠耐多藥結(jié)核病模型；與對(duì)照組相比，各疫苗治療組均有明顯的療效，尤其是Ag85A DNA疫苗單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合化療的療效明顯強(qiáng)于Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗、HSP65 DNA疫苗和微卡菌苗組，與抑菌藥PZA相當(dāng)。其機(jī)制可能是抗結(jié)核藥物雖不能殺滅耐多藥 Mtb，但對(duì)該菌具有一定的抑制作用；Ag85A DNA疫苗能調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能殺滅已被抑制的Mtb，并增強(qiáng)RFP或PZA對(duì)耐多藥Mtb的殺菌效力。ESAT 6與Ag85A嵌合構(gòu)建的DNA疫苗未能增強(qiáng)Ag85A DNA疫苗的治療效果，可能是由于ESAT6是Mtb毒力因子所致，由此可見(jiàn)抗原的選擇至關(guān)重要。

總之，結(jié)核病是一種細(xì)菌性傳染性疾病，從另一個(gè)角度來(lái)看也是一種細(xì)胞免疫疾病，Mtb Ag85A DNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，可減少小鼠組織中的Mtb尤其是耐多藥Mtb的數(shù)目，該疫苗與常規(guī)化療聯(lián)合不僅可提高機(jī)體免疫力，并可有效地殺滅或抑制Mtb，提高化療效果，縮短療程，從而為結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療開(kāi)辟了新途徑。

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［3］吳雪瓊，李洪敏，史迎昌，等.結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗抗結(jié)核作用的研究.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2002，15（6）：340－345.

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［5］Liang Y，Wu X，Zhang J，et al.The treatment of mice infected with multi－drug－resistant Mycobacterium tuberculosis using DNA vaccines or in combination with rifampin.Vaccine，2008，26（35）：4536－4540.

［6］白雪娟，李寧，余琦，等.DNA疫苗對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌耐藥株小鼠治療效果的病理學(xué)評(píng)價(jià).中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2010，5（1）：74－79.