胰腺癌的基因治療進(jìn)展

王飛 趙海平

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，010050)

胰腺癌的基因治療進(jìn)展

王飛 趙海平

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，010050)

近年來(lái)，胰腺癌的基因治療作為一種新的治療手段備受關(guān)注，其很多研究已進(jìn)入臨床階段。胰腺癌基因治療的研究主要包括：基因信號(hào)傳導(dǎo)抑制、基因治療等。本文就近期胰腺癌的基因治療研究成果與存在的問(wèn)題作一綜述。

胰腺癌；基因治療；進(jìn)展

胰腺癌是目前最難治愈的惡性腫瘤之一，其特點(diǎn)為起病比較隱蔽，早期不易發(fā)現(xiàn)，且惡性程度高，可呈多中心播散，不能手術(shù)完整切除，病程較短，其生存期一般不到一年。所以積極尋找治療胰腺癌的方法為當(dāng)務(wù)之急。目前認(rèn)為胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，伴隨著多種基因改變。基因治療是指將外源基因或核酸導(dǎo)入人體防治疾病的一種新技術(shù)和新的治療方法。20世紀(jì)80年代基因治療的研究和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的開(kāi)發(fā)，為基因治療提供了理論依據(jù)與技術(shù)方法。

1 基因傳導(dǎo)信號(hào)抑制

1.1 Ras K-ras基因位于染色體的12p12，長(zhǎng)度約45 000個(gè)堿基對(duì)，編碼2.0kb，高度保守位于膜上的p21-ras偶聯(lián)蛋白，功能是將細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的信號(hào)由激活的受體傳導(dǎo)于蛋白激酶[1]。正常情況下，Ras蛋白始終處于GDP結(jié)合失活和GTP結(jié)合激活兩種狀態(tài)的循環(huán)中。活化狀態(tài)的Ras蛋白通過(guò)ras-raf-MEK-MAPK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，該通路與細(xì)胞的增生分化相連，造成細(xì)胞不可控制的增生、惡變?；罨癄顟B(tài)的Ras蛋白還可能通過(guò)ras-ral/cdc42-MEKK1-JNK/SAPK及ras-PI3K-Akt細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞惡變。另外，K-ras基因能下調(diào)經(jīng)DPC4-SMADs-TGF2B徑產(chǎn)生的抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)[2]，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控。由于K-ras基因突變的作用，使突變K-ras基因成為重要的治療靶向，針對(duì)突變K-ras基因的各種基因治療均能有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Kato等[3]用UIsnRNA攜帶反義RNA，他們將反義RNA插入U(xiǎn)IsnRNA5'端游離區(qū)，此區(qū)不同的反義RNA可使UIsnRNA與不同的mRNA前體結(jié)合，將上述UIsnRNA攜帶針對(duì)K-ras突變基因的反義RNA插入質(zhì)粒pEUK/nU1，并轉(zhuǎn)移多個(gè)胰腺癌細(xì)胞系后，癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢或停止，細(xì)胞集落形成數(shù)下降90%，并使種植于裸鼠的腫瘤消退。Wang等[4]通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染針對(duì)K-ras的siRNA進(jìn)入胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，通過(guò)R-PCR免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)K-ras的表達(dá)水平顯著降低。

1.2 花生四烯酸代謝通路 花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是含二十碳的不飽和脂肪酸，其代謝主要通過(guò)以下兩條途徑。在環(huán)加氧酶(cyclo-oxygenas，COX)作用下，AA轉(zhuǎn)化為前列腺素(prostaglandins，PG)和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)。AA在脂加氧酶(lipoxygenase)催化下代謝終產(chǎn)物為白三烯(leukotrienes，LTs)。LOXs是一組具有加氧酶和過(guò)氧化氫酶雙重活性的同功酶，根據(jù)其作用底物位置特異性分別命名為5-，8-，12-，15-LOX。AA經(jīng)過(guò)這4個(gè)酶的催化形成5-，8-，12-，15-羥基花生四烯酸(hydroxy-eicosatetraenoic acid，HETEs)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成LTs。近年來(lái)有資料表明在胰腺癌的研究中觀察到明顯的COX和LOX代謝途徑異常[5]，證明花生四烯酸與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這使得許多研究者開(kāi)始探討以上兩條通路能否成為胰腺癌預(yù)防或治療的靶點(diǎn)。

研究表明[5-6]，在多種胰腺癌細(xì)胞系中，可以檢測(cè)到5-LOXmRNA以及蛋白的高表達(dá)，且5-LOX在胰腺癌病理機(jī)制中可能具有關(guān)鍵地位。另一方面，LOX代謝產(chǎn)物，包括5-LOX和12-LOX也顯示促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增生的作用。5-HETE和12-HETE通過(guò)多條信號(hào)通路發(fā)揮作用，如激活P44/22有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3/AKT激酶途徑，可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA合成。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，COX和LOX途徑與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)[7-8]。在胰腺癌中，過(guò)度激活的COX和LOX代謝通路使其成為令人注目的潛在治療靶點(diǎn)。上述研究表明，抑制COX和LOX通路具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等功能。

1.3 PI3-K/AKT通路 PI3-K(磷脂肌醇3-激酶)是磷脂激酶家族中的一個(gè)重要成員，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。AKT(蛋白激酶B，PKB)是PI3-K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性，可在PI3-K作用下生成磷酸化AKT(phosphorylated AKT，pAKT)而激活，pAKT又進(jìn)一步激活下游因子而發(fā)揮其作用[9]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是機(jī)體維持氧自穩(wěn)平衡的核心調(diào)控因子，可調(diào)控一系列缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)。缺氧以及非缺氧刺激可通過(guò)PI3-K/AKT依賴或相關(guān)的途徑誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)和活化[10]。謝祚啟等發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境下LY294002聯(lián)合吉西他濱可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的化療敏感性[11]。

PI3-K/AKT信號(hào)通路控制著眾多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生、細(xì)胞凋亡、增生、細(xì)胞周期的調(diào)控以及細(xì)胞的遷移侵襲等[12]。Yamamoto S等人的研究也證明在胰腺癌中PI3-K/AKT信號(hào)通路被活化，表達(dá)明顯高于正常組織，且認(rèn)為pAKT是胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)之一[13]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)抑制PI3-K/AKT信號(hào)通路的活性后，明顯抑制了胰腺癌細(xì)胞的增生，促進(jìn)其凋亡，降低了癌細(xì)胞的侵襲能力[14]，而在胰腺癌PC-3細(xì)胞中抑制HIF-1α蛋白表達(dá)而下調(diào)其下游的VEGF和GPI基因的轉(zhuǎn)錄，可抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增生[15]。

2 基因治療

2.1 自殺基因 亦稱為基因定向酶藥物前體療法，首先利用載體將編碼某種特定酶的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，然后給予能被該酶選擇性活化的藥物前體治療。因?yàn)樵撁竷H在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此腫瘤細(xì)胞中可聚集高濃度具有毒性的藥物，從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過(guò)旁觀者效應(yīng)導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡。研究較多的自殺基因治療系統(tǒng)有HSV-TK/GCV和CD/5-FC，在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均可抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.1.1 HSV-TK/GCV系統(tǒng) 單純皰疹病毒(HSV)1型或2型胸苷激酶(TK)基因編碼的胸苷激酶能特異性地將核苷類似物等如羥甲基無(wú)環(huán)鳥苷(GCV)磷酸化，在胞內(nèi)進(jìn)一步代謝生成三磷酸GCV，可抑制細(xì)胞DNA聚合酶和作為DNA合成的終結(jié)者，使腫瘤細(xì)胞對(duì)GCV敏感性大大增高，從而明顯提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。用于HSV-TK基因療法的前藥有兩類，一是嘌呤核苷類似物，包括阿昔洛韋(ACV)及其衍生物GCV、潘洛昔非(PCV)和布洛昔非(BCV)，其中GCV對(duì)轉(zhuǎn)基因瘤細(xì)胞的抑制作用比ACV強(qiáng)10倍，故成為目前腫瘤TK基因治療中最常用的前藥；另一類是嘧啶核苷類似物，主要是BVDU。劉為青等[16]近期試驗(yàn)證明，HSV-TK+GFP/GCV自殺基因系統(tǒng)在體內(nèi)外對(duì)小鼠胰腺癌均有殺傷作用，且存在明顯的旁觀者效應(yīng)。

2.1.2 CD/5-FC系統(tǒng) CD基因能催化5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC) 轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，而5-FU具有高度的細(xì)胞毒作用，能抑制RNA和DNA的合成而致細(xì)胞死亡。Pan等[17]用含有CD基因的腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Patu8988和SW1990，然后加入5-FC，結(jié)果5-FC對(duì)CD基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，而對(duì)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞作用微弱。同時(shí)Balb/c裸鼠皮下注射1.0×107Patu8988/SW1990細(xì)胞建立胰腺癌體內(nèi)模型，在可觸及腫瘤后給予瘤內(nèi)注射Ad-CD，腹腔注射5-FC，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯受到抑制。

2.2 反義基因 這種方法的目的是阻止腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，將小分子的反義寡核苷酸運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，它們可互補(bǔ)的結(jié)合到DNA或RNA的特異序列上，而在多方面對(duì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的基因起干擾抑制作用。它結(jié)合到DNA單鏈上后，可引起轉(zhuǎn)錄停滯；結(jié)合到mRNA或rRNA后，可引起翻譯停滯；它還可通過(guò)干擾RNA間接影響RNA在細(xì)胞內(nèi)不同部分間的運(yùn)動(dòng)，使腫瘤基因無(wú)法表達(dá)。其缺點(diǎn)主要是特異性有限，核酶和RNA干擾技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以及與病毒載體的結(jié)合，有望使反義基因治療更加特異，并且在體內(nèi)長(zhǎng)期發(fā)揮作用。

針對(duì)k-RAS、ATK2、erbB-2癌基因的突變作為反義基因治療靶點(diǎn)，以癌基因的mRNA全長(zhǎng)作為反義鏈與細(xì)胞內(nèi)的癌基因序列結(jié)合，從而阻斷基因翻譯過(guò)程，反義基因治療目前應(yīng)用較多。ISIA-2503是原癌基因H-ras的反義抑制劑，一種20堿基反義寡核苷酸鏈，能夠與人rasmRNA翻譯起始區(qū)堿基雜交，使RNA降解而減少其表達(dá)。Perez和Burch先后用ISIA2503對(duì)進(jìn)展期胰腺癌病人進(jìn)行了Ⅱ期臨床試驗(yàn)[18-19]。韓旭等[20]分別用整合素αV、β3及αVβ3反義基因治療大鼠胰腺癌，發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制大鼠胰腺癌組織的血管生長(zhǎng)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響腫瘤生長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用整合素αVβ3對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用更為顯著。

2.3 免疫基因治療 免疫基因治療就是將各種細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞。使其在機(jī)體表達(dá)分泌細(xì)胞因子或利用其他基因分子增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性或免疫系統(tǒng)功能，以加速腫瘤消退的方法。

2.3.1 腫瘤疫苗 腫瘤疫苗是將腫瘤特異性抗原交給抗原呈遞細(xì)胞，使患者的免疫系統(tǒng)能識(shí)別腫瘤細(xì)胞。目前采用的將編碼抗原的基因轉(zhuǎn)染到樹突細(xì)胞的技術(shù)，可以保障疫苗的效力并且避免了MHC限制，同時(shí)也避免靜脈應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑的副作用。GM-CSF基因是目前激活免疫系統(tǒng)的最有效基因之一，它能吸引免疫細(xì)胞聚集到表面存在抗原體的腫瘤細(xì)胞處。這些抗原體可以引導(dǎo)免疫系統(tǒng)找出并破壞殘留在病人體內(nèi)其他位置的癌細(xì)胞。Laheru等報(bào)道的能產(chǎn)生GM-CSF的胰腺癌疫苗聯(lián)合手術(shù)治療已經(jīng)通過(guò)了Ⅱ期臨床試驗(yàn)，2年生存率達(dá)到了76%[21]。

2.3.2 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子介導(dǎo)治療就是通過(guò)把細(xì)胞因子基因在體外導(dǎo)入受體細(xì)胞后，產(chǎn)生免疫原性后再回輸機(jī)體，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，或?qū)⒓?xì)胞因子基因直接導(dǎo)入體內(nèi)，在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生細(xì)胞因子而發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞因子介導(dǎo)治療腫瘤的作用途徑分為兩種，一是通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面腫瘤相關(guān)抗原、MHC分子或黏附分子的表達(dá)而提高腫瘤的免疫原性；二是通過(guò)直接刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞而達(dá)到增強(qiáng)免疫反應(yīng)的目的。目前，細(xì)胞因子治療已從單細(xì)胞因子治療向多種細(xì)胞因子聯(lián)合治療方向過(guò)渡。一些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，如IL-2，IL-12等，還有就是利用細(xì)胞因子直接殺傷腫瘤細(xì)胞，如利用病毒載體將TNF基因準(zhǔn)確導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞自體表達(dá)TNF，TNF能直接殺死這些細(xì)胞。白介素IL-2基因修飾的胰腺癌細(xì)胞瘤苗，可產(chǎn)生特異性主動(dòng)免疫反應(yīng)，聯(lián)合IL-2基因和γ干擾素(IFN-)基因能誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。胰腺癌腫瘤內(nèi)注射重組人腫瘤壞死因子可抑制腫瘤生長(zhǎng)。Sato等[22]在胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPCl、PANcl中轉(zhuǎn)染TNF受體R55基因，表現(xiàn)出顯著高于其母代細(xì)胞系的TNF敏感性，聯(lián)合應(yīng)用突變型TNF471具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用。唐瑞峰等[23]在研究細(xì)胞因子IL-2和IL-6對(duì)胰腺癌細(xì)胞表達(dá)VEGF-D的調(diào)節(jié)中證實(shí)，IL-2使細(xì)胞株SW1990和BXPC-3產(chǎn)生VEGF-D mRNA減少；IL-2抑制胰腺癌細(xì)胞VEGF-D mRNA的表達(dá)，從而抑制胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.4 RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNAi)是生物體內(nèi)由具有同源性的雙鏈RNA(dsDNA)引發(fā)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾技術(shù)是一種十分有前途的基因治療方法，已廣泛應(yīng)用到胰腺癌的基因治療研究之中，包括采用RNA干擾技術(shù)抑制癌基因、抗凋亡因子；利用RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移蛋白來(lái)探討治療胰腺癌；利用RNA干擾技術(shù)提高胰腺癌對(duì)化療的敏感性等。Chen等[24]報(bào)道建立K-ras(val12)突變基因的siRNA腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Panc-1胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型；Wang[4]等通過(guò)構(gòu)建K-ras基因的siRNA表達(dá)框架(SEC)成功抑制胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2的K-ras表達(dá)；有研究證實(shí)[25]利用RNAi抑制凋亡相關(guān)基因Survivn表達(dá)，可誘導(dǎo)PC-2胰腺癌細(xì)胞株凋亡，并能提高其輻射敏感性。

但根據(jù)RNAi的目前研究現(xiàn)狀，“RNA干擾劑”應(yīng)用于臨床仍有一系列課題需要攻克，如：siRNA的給藥途徑、靶向性、siRNA的穩(wěn)定性等。此外，利用RNAi技術(shù)多靶點(diǎn)聯(lián)合敲減腫瘤相關(guān)基因，提高抗腫瘤療效也將是RNAi技術(shù)發(fā)展方向之一。

3 結(jié)論

目前腫瘤的基因治療研究正成為熱點(diǎn)。雖然目前臨床應(yīng)用并不十分滿意，但動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果令人振奮。一些選擇復(fù)制性病毒及腫瘤疫苗的研究已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)階段，使胰腺癌患者看到了希望。但受基因靶位及載體選擇的限制，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效性，表達(dá)調(diào)控等技術(shù)方面的影響，而且采用的任何一種基因治療措施都不盡完善，還存在許多問(wèn)題，如對(duì)重組基因的安全性還認(rèn)識(shí)不清、基因轉(zhuǎn)染效率低等直接影響到基因治療的效果。加之，胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，治療目的性不十分明確，也影響了基因治療的研究。將基因療法廣泛應(yīng)用于臨床尚待時(shí)日。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的基礎(chǔ)研究，尋找更具特異性的檢測(cè)和治療靶位點(diǎn)，多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)及多基因、多因素聯(lián)合應(yīng)用是今后胰腺癌研究的熱點(diǎn)和發(fā)展方向。

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Gene therapy for pancreatic cancer，as a new treatment method，has aroused great attention in recent years，and much of its research has entered the clinical stage.The research of gene therapy for pancreatic cancer mainly include：gene signal transduction suppression，gene therapy，and etc.This paper summarizes the research results and existing problems of recent gene therapy for pancreatic cancer.

Pancreatic cancer；Gene therapy；Progress

1005-619X(2012)05-0413-04

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20080404MS1102)通訊作者：趙海平