細胞外信號調(diào)節(jié)激酶在蛛網(wǎng)膜下腔出血損傷中的作用及意義

李 冉， 劉 江， 崔建忠， 王凱杰， 徐愛軍， 王海濤， 高俊玲

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)可導(dǎo)致顱內(nèi)發(fā)生一系列并發(fā)癥，是患者病殘和死亡的主要原因［1］。研究證實SAH后血管壁內(nèi)皮細胞凋亡現(xiàn)象在SAH病理進程中起關(guān)鍵作用［2］，最終可導(dǎo)致腦損傷后期的神經(jīng)功能缺陷［3］。細胞凋亡多通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine asparti cacid-specific protease，caspase)介導(dǎo)的信號途徑完成，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)級聯(lián)途徑是SAH后重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已有研究證實腦缺血性損傷中ERK在炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮了重要作用［4］，應(yīng)用ERK抑制劑U0126預(yù)處理可減少腦創(chuàng)傷模型60%的腦部損傷面積［5］。類似機制是否存在于SAH模型小鼠神經(jīng)元凋亡過程仍不清楚。近年的研究多集中于SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)及并發(fā)癥的防治，對SAH早期腦損傷分子機制研究甚少。本研究對ERK、caspase-8在小鼠SAH損傷中的作用進行研究，旨在探討ERK通路在SAH早期腦損傷中的分子機制。

1 材料和方法

1．1 材料 β-actin鼠單克隆抗體(Sigma)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG(Sigma)，預(yù)染蛋白 Marker(灝洋生物)，phosphorated-ERK多克隆抗體(Cell signaling)，TUNEL試劑盒(Roche)，U0126(Promega)，caspase-8 兔抗鼠多克隆抗體(Santa cruz biotechnology，Inc)。健康雄性ICR小鼠由北京維通利華動物中心［SCXK(京)2002-2003］90只，體質(zhì)量28～32g，隨機分為假手術(shù)對照組(Sham組)18只;模型組(SAH組)36只;U0126干預(yù)組(SAH+U0126組)36只，各組分為SAH 12、24、48h 3 個亞組。

1．2 方法

1．2．1 動物模型的制備 參照文獻［6］的方法并略作改良，麻醉消毒后，于手術(shù)顯微鏡下自小鼠右側(cè)頸外動脈(ECA)經(jīng)頸內(nèi)動脈(ICA)導(dǎo)入5-0單纖維尼龍線，至大腦前動脈(ACA)與大腦中動脈(MCA)分叉處，刺破動脈壁，總進入長度約為(10±0．5)mm。假手術(shù)對照組將尼龍線僅送至ACA與MCA分叉處，稍感阻力即停止繼續(xù)插入，并迅速退出尼龍線。結(jié)扎頸外動脈的斷端，縫合皮膚，單籠飼養(yǎng)。將UO126溶解于DMSO中，于出血前30min 經(jīng)尾靜脈注射(0．05mg/kg，0．1mg/kg)，出血前30min、24h、48h 各給藥一次。

1．2．2 MCA形態(tài)學(xué)觀察 常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察MCA形態(tài)學(xué)改變。

1．2．3 TUNEL法檢測大腦中動脈內(nèi)皮細胞凋亡 小鼠麻醉開胸，70mmHg壓力下經(jīng)左心室灌注等滲鹽水至流出液體清亮，4%多聚甲醛PBS(pH 7．2 ～7．4)緩沖液 100ml灌注，斷頭取腦，取大腦中動脈至大腦前動脈分叉處前后3mm范圍的腦組織冠狀切開，入4%多聚甲醛室溫后固定2h，入4℃20%蔗糖磷酸鹽緩沖液，應(yīng)用恒冷箱切片機連續(xù)冠狀切片，片厚20μm。按原位細胞凋亡檢測試劑盒提供的實驗步驟進行，DAB顯色。采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像自動分析系統(tǒng)進行TUNEL陽性細胞計數(shù)，隨機記數(shù)小鼠MCA陽性細胞數(shù)。

1．2．4 免疫印跡法檢測大腦動脈p-ERK1/2、caspase-8蛋白表達 10%水合氯醛(0．30ml/kg)腹腔注射麻醉動物后斷頭取腦，于手術(shù)顯微鏡下低溫快速分離右側(cè)大腦動脈(ICA、ACA、MCA)，置于4℃預(yù)冷的全細胞裂解液0．6ml冰水浴中勻漿，12000r/min 4℃離心5min，取上清液。以考馬斯亮藍G250結(jié)合法蛋白定量，－80℃保存?zhèn)溆?。?5μg蛋白樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5min，6000r/min離心3min，取上清液上樣，用12%(w/v)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉2h，分別加入p-ERK1/2、caspase-8一抗4℃過夜，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗和預(yù)染蛋白Marker，室溫下震蕩孵育1h，濾膜漂洗后加入 DAB顯色。將特異性蛋白條帶進行掃描后，在同一條件下應(yīng)用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定目標(biāo)條帶整合光密度值(IDV)，計算出各組樣品目標(biāo)條帶與內(nèi)參(β-actin)的IDV比值。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗中所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS 12．0軟件，對其進行單因素方差分析，相關(guān)因素進行相關(guān)分析，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 顱底解剖學(xué)檢查 假手術(shù)組無出血。SAH造模后各時間點均有明顯出血，累及整個Willis環(huán)，尤以右側(cè)為著;SAH 48h出血部分吸收，可見陳舊性血塊附著于Willis環(huán)周圍，符合SAH研究要求。

2．2 MCA形態(tài)學(xué)改變 假手術(shù)組MCA管腔光滑，內(nèi)皮細胞排列平整。與假手術(shù)組相比，SAH 48h MCA呈現(xiàn)強力收縮，HE染色下內(nèi)彈性膜呈波紋狀皺縮，內(nèi)皮細胞腫脹，排列不整齊，被鄰近波紋狀的內(nèi)彈性膜扭曲而突向腔內(nèi)，血管壁顯著增厚，管腔明顯狹窄，平滑肌細胞收縮，個別內(nèi)皮細胞脫落。U0126可緩解CVS，改善內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞壞死。

2．3 TUNEL檢測MCA細胞凋亡結(jié)果 假手術(shù)組偶見TUNEL陽性細胞(1．305±0．12)。模型組12h TUNEL陽性細胞開始增加，48h達高峰，細胞胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)凝集，核深染，呈深棕色顆粒狀，陽性細胞在MCA所有層面均有表達，尤以內(nèi)皮細胞及中膜平滑肌細胞為著，SAH12、24、48h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(11．253 ± 0．121，33．663 ± 0．118，58．174 ±0．115;均P＜0．05)。U0126 干預(yù)組各時相點TUNEL陽性細胞均不同程度減少，24、48h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(29．312 ±0．119，41．327 ±0．117;均P＜0．05)。

2．4 免疫印跡法檢測結(jié)果

2．4．1 p-ERK1/2蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果假手術(shù)組少量p-ERK1/2表達;模型組p-ERK1/2在出血后12h明顯增加，24h達高峰，48h降低，12、24、48h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。U0126干預(yù)組各時相點p-ERK1/2表達均有不同程度降低;24、48h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

2．4．2 caspase-8蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果假手術(shù)組caspase-8少量陽性表達，模型組12h蛋白量明顯增加，24h達高峰，48h降低，但仍高于基礎(chǔ)水平，12、24、48h 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。U0126干預(yù)組各時相點caspase-8表達均有不同程度降低;12、24、48h差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

3 討論

本實驗顯示模型組小鼠痙攣大腦動脈TUNEL染色呈陽性，在MCA所有層面均有表達，說明凋亡在SAH損傷中發(fā)揮了重要作用。研究證實SAH后血管壁細胞凋亡和在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)的血管壁增生及構(gòu)建相關(guān)［7］，因此，減少或阻斷細胞凋亡通路是保護腦組織的一個重要的治療方向。

神經(jīng)元凋亡與出血后腦組織復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活具有相關(guān)性，其中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的 ERK通路發(fā)揮了重要作用。有研究表明利用多巴胺能受體轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)ERK激活主要發(fā)生在直接轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中［8］。本實驗中SAH24h p-ERK1/2表達達高峰，隨時間延長TUNEL陽性細胞增加，提示本次實驗條件下，ERK的激活可能導(dǎo)致了細胞凋亡，出血后凋亡的發(fā)生與 CVS密切相關(guān)［9］，p-ERK1/2在CVS進程中起了重要的作用［10］。ERK1/2是一種重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，當(dāng)有害刺激信號作用于細胞表面受體時，可激活GTP結(jié)合蛋白RAS，繼而激活Raf-1，Raf-1可磷酸化MEK，p-MEK進一步磷酸化ERK1/2，之后p-ERK1/2使細胞核內(nèi)的Elk-1磷酸化，此瀑布式磷酸化活化過程將激活與細胞損傷有關(guān)的即刻反應(yīng)基因和晚反應(yīng)基因的表達，調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。Aoki等［11］利用兩次注血 SAH模型觀察到，注血可造成基底動脈CVS，MEK抑制劑PD98059可明顯降低ERK1/2表達水平，并且可顯著逆轉(zhuǎn)CVS，使痙攣的血管內(nèi)徑增加。本實驗中顱底解剖可見大量出血，鏡下觀察顯示出血可導(dǎo)致SAH小鼠MCA管腔狹窄、管壁增厚，受傷小鼠患側(cè)對側(cè)肢體癱瘓，出現(xiàn)左旋追尾現(xiàn)象，說明SAH后強烈的血管痙攣可能造成行為學(xué)改變。ERK表達高峰早于TUNEL陽性標(biāo)記的高峰，說明ERK發(fā)生時間早于凋亡;抑制劑組p-ERK1/2的表達水平明顯低于模型組，提示U0126可通過調(diào)節(jié)p-ERK1/2的活化水平而影響凋亡進程，可能對出血性腦損傷具有保護作用。

為明確p-ERK1/2是否誘導(dǎo)了caspase凋亡通路，本實驗應(yīng)用ERK抑制劑，并檢測了下游caspase-8表達。caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，由上游啟動型caspase激活下游效應(yīng)caspase組成瀑布式級聯(lián)反應(yīng)。啟動型caspase包括caspase-2、8、9和10，通過自身活化啟動凋亡程序并調(diào)節(jié)效應(yīng)型caspase-3;效應(yīng)型caspase包括caspase-3、6和7，能分解細胞蛋白引起細胞凋亡。caspase蛋白酶主要以無活性酶原形式存在于細胞質(zhì)中，受到凋亡刺激后被激活，直接參與凋亡早期啟動和凋亡信號的傳遞。本實驗觀察到出血后caspase-8免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元不斷增加，至SAH 48h與凋亡細胞數(shù)目同時達高峰，進一步說明caspase-8活化可能是SAH后細胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究證實caspase-8是關(guān)鍵的啟動型caspase，其可通過特殊的細胞信號途徑導(dǎo)致caspase-3激活，將凋亡信號傳至caspase-3，caspase-3活化物能裂解DNA修復(fù)酶，使細胞不可逆地發(fā)生凋亡改變，包括核濃縮和 DNA斷裂，最終導(dǎo)致細胞凋亡［12］。

本實驗中ERK抑制劑U0126在抑制p-ERK1/2的同時部分阻抑了caspase-8的活化，提示ERK可能位于上游并可活化caspase-8。應(yīng)用U0126可在腦損傷的啟動階段通過阻抑p-ERK1/2、caspase-8等一系列級聯(lián)因子的作用，減少凋亡細胞的增加，在損傷的上游階段阻斷病情發(fā)展，其對出血性神經(jīng)損傷可能具有一定的靶向作用。

［1］Cengiz SL，Erdi MF，Avunduk MC，et al．The role of intravenous immunoglobulin in the treatment of cerebral vasospasm induced by subarachnoid haemorrhage:A experimental study［J］．Brain Inj，2011，25(10):965－971．

［2］Ayer RE，Ahang JH．Oxidative stress in subarachnoid haemorrhage:significance in acute brain injury and vasospasm［J］．Acta Neurochir Suppl，2008，104(1):33 －34．

［3］Cahill J，Calvert JW，Zheng JH．Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(11):1341－1353．

［4］Lu K，Cho CL，Liang CL，et al．Inhibition of the MEK/ERK pathway reduces microglial activation and interleukin-1-beta expression in spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats［J］．J Thorac Cardiovasc Surg，2007，133(4):934 －941．

［5］Clausen F，Lundqvist H，Ekmark S，et al．Oxygen free radical-dependent activation of extracellular signal-regulated kinase mediates apoptosis-like cell death after traumatic brain injury［J］．J Neurotrauma，2004，21(9):1168 －1182．

［6］Gao J，Wang H，Sheng H，et al．A novel apoE-derived peptide therapeutic reduces vasospasm and improves outcome in a murine model of subarachnoid hemorrhage［J］．Neurocrit Care，2006，4(1):25 －31．

［7］Zhou C，Yamaguchi M，Colohan AR，et al．Role of p53 and apoptosis in cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(5):572 －582．

［8］Santini E，Alcacer C，Cacciatore S，et al．L-DOPA activates ERK signaling and phosphorylates histone H3 in the striatonigral medium spiny neurons of hemiparkinsonian mice［J］．J Neurochem，2009，108(3):621－633．

［9］Kawanabe Y，Masaki T，Hashimoto N．Involvement of epidermal growth factor receptor-protein tyrosine kinase transactivation in endothelin-1-induced vascular contraction［J］．Neurosurgery，2004，100(6):1066－1071．

［10］Kusaka G，Kimura H，Kusaka I，et al．Contribution of Src tyrosine kinase to cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage［J］．Neurosurgery，2003，99(2):383 －390．

［11］Aoki K，Zubkov AY，Tibbs RE，et al．Role of MAPK in chronic cerebral vasospasm［J］．Life Sci，2002，70(16):1901 －1908．

［12］Ferrer I，Planas AM．Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2003，62(4):329 －339．