RASSF1A抑癌基因在腫瘤中的研究進(jìn)展

陳譚根，李建國

2000年，Dammann等［1］利用酵母菌雙雜交法從肺癌細(xì)胞株3號(hào)染色體短臂篩選出一種互補(bǔ)DNA，其編碼的蛋白質(zhì)能與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用。因其核苷酸序列的羧基末端與小鼠RAS效應(yīng)蛋白Nore1高度同源，遂命名為RAS相關(guān)區(qū)域家族1(RAS association domain family 1，RASSF1)。已有研究表明，其亞型RASSF1A基因的失活在多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，本文就RASSF1A基因與腫瘤的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RASSF1A基因的定位和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

RAS相關(guān)區(qū)域家族包含10個(gè)成員(RASSF1-10)［2］，RASSF1 基因位于人染色體 3p21.3 上，全長11 kb。由于選擇性剪切和不同啟動(dòng)子的使用，RASSF1基因至少存在8種不同的轉(zhuǎn)錄本(RASSF1A-H)。其中RASSF1A和RASSF1C為兩個(gè)主要的亞型，由兩個(gè)相距3.5 kb的不同CpG島啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，含有4個(gè)共同的外顯子(3，4，5，6)，幾乎表達(dá)于所有的正常組織中。RASSF1A的cDNA 全長1 968 bp，包含6個(gè)外顯子(1α，2αβ，3，4，5，6)，編碼產(chǎn)物為含340個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為 39 kDa［3］。目前研究 發(fā) 現(xiàn)RASSF1A蛋白含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域:(1)RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域，RASSF1A通過其RAS結(jié)構(gòu)域與RAS-GTP結(jié)合，調(diào)節(jié)RAS介導(dǎo)的RAS/RAF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［4］;(2)SARAH結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的相互作用，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡的通路中起關(guān)鍵作用［5］;(3)ATM(ataxia telangiectasia mutated)磷酸化位點(diǎn)，參與維持基因組的穩(wěn)定性［6］;(4)C1/DAG結(jié)合域，也稱為蛋白激酶C保守區(qū)域1(protein kinase C conserved region 1，PKCC1)，參與調(diào)節(jié)微管系統(tǒng)，維持基因組穩(wěn)定［7］;(5)SH3 結(jié)合結(jié)構(gòu)域［8］，具體作用機(jī)制還有待研究。

2 RASSF1A主要生物學(xué)功能與機(jī)制

研究表明，RASSF1A的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和降低腫瘤細(xì)胞株的致瘤性［9］。作為骨架蛋白，組裝和調(diào)節(jié)多個(gè)效應(yīng)蛋白復(fù)合物相互作用。RNA干擾(RNAi)實(shí)驗(yàn)提示RASSF1A基因表達(dá)下調(diào)可使細(xì)胞周期調(diào)控缺失，增強(qiáng)遺傳不穩(wěn)定性及細(xì)胞活力，還可以對(duì)抗K-RAS和TNF-α所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］。RASSF1A參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，作用機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)分述如下。

2.1 RASSF1A調(diào)節(jié)微管維持基因組穩(wěn)定 有絲分裂過程中，染色體的正確分離直接取決于有效運(yùn)轉(zhuǎn)的微管網(wǎng)絡(luò)。微管是在聚合和解聚兩種狀態(tài)下不斷轉(zhuǎn)換的聚合物。微管動(dòng)力是由微管結(jié)合蛋白(MAPs)直接結(jié)合微管蛋白調(diào)節(jié)的，MAPs的主要作用是保護(hù)微管的穩(wěn)定性，避免解聚和介導(dǎo)微管與其他細(xì)胞成分之間的相互作用。MAPs含3種蛋白質(zhì):MAP1b，C19ORF5(chromosome 19 open reading frames 5)和MAP4。其中MAP1b和C19ORF5增強(qiáng)微管聚合，而MAP4阻礙微管解聚。RASSF1A可能通過MAPs與微管相關(guān)聯(lián)。RASSF1A蛋白在分裂間期分布在細(xì)胞質(zhì)微管中，在分裂前期分布于中心體，在有絲分裂中期和后期分布于紡錘體微管和紡錘體極，在末期分布于中間體。RASSF1A與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管穩(wěn)定及調(diào)節(jié)有絲分裂過程［11］。紡錘體調(diào)節(jié)的缺失可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，而基因組不穩(wěn)定性是變異細(xì)胞的標(biāo)志之一。由于RASSF1A基因分布于中心體和紡錘體，調(diào)節(jié)微管蛋白的動(dòng)力學(xué)，故 RASSF1A與維持基因組的穩(wěn)定性相關(guān)。RASSF1A的細(xì)胞器分布還與 C19ORF5有關(guān)。C19ORF5是一種超穩(wěn)定的特殊微管結(jié)合蛋白，與RASSF1A基因表達(dá)下調(diào)相似，通過 RNAi抑制C19ORF5表達(dá)同樣可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。C19ORF5可提高RASSF1A穩(wěn)定有絲分裂細(xì)胞周期蛋白的能力。RASSF1A含ATM激酶磷酸化位點(diǎn)，而ATM具有參與DNA損傷檢查點(diǎn)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，人類腫瘤中存在點(diǎn)突變導(dǎo)致RASSF1A的ATM位點(diǎn)損傷［12］。盡管目前很難明確ATM點(diǎn)突變和野生型的RASSF1A調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性有無區(qū)別，但有學(xué)者認(rèn)為RASSF1A調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性可能與ATM有關(guān)［13］。

2.2 RASSF1A調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 RASSF1A可調(diào)節(jié)Rb家族進(jìn)入S期的細(xì)胞周期限制點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。RASSF1A在肺癌和乳腺癌細(xì)胞系(NCIH1299和HME50-hTERT)的過表達(dá)可抑制細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)蓄積(通過抑制mRNA翻譯)，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯。這種現(xiàn)象可被異位表達(dá)cyclin D1或者G1/S期的其他下游活化分子(如cyclin A和 E7)而逆轉(zhuǎn)。Agathanggelou等［14］研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞G1周期停滯，并伴有cyclin D1表達(dá)水平下調(diào)。通過酵母雙雜交篩選，p120E4F已被確定為RASSF1A相互協(xié)同作用分子之一，p120E4F抑制cyclinA2的轉(zhuǎn)錄，協(xié)同RASSF1A誘導(dǎo) G1-S期停滯［15］;而 RASSF1A 也協(xié)同p120E4F抑制cyclinA2。敲除乳腺癌HB2細(xì)胞系的內(nèi)源性RASSF1A，p120E4F與cyclinA2啟動(dòng)子的結(jié)合則明顯減少;在穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A的肺癌A549細(xì)胞系中，p120E4F與cyclinA2的結(jié)合顯著增強(qiáng)［16］。cyclinA2是RASSF1A與 p120E4F共同作用的細(xì)胞靶點(diǎn)，從而控制S期進(jìn)程，由此推測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控存在RASSF1A依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。RASSF1A還通過JNK通路促使G1期停滯。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RASSF1A的肺癌H1299細(xì)胞中，JNK和cjun磷酸化降低，JNK活性受到抑制并伴有cyclin D1表達(dá)水平下調(diào)。RASSF1A還能通過其SARAH結(jié)構(gòu)域直接作用于MST1激酶，調(diào)節(jié)JNK活性和阻斷信號(hào)傳遞［17］。

2.3 RASSF1A與細(xì)胞凋亡 RASSF1A可能參與了多條不同的細(xì)胞凋亡途徑。Baksh等［18］研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A是死亡受體誘導(dǎo)Bax構(gòu)象改變和凋亡所必須的。在受體刺激后，RASSF1A和MOAP-1(modulator of apoptosis-1)募集和形成復(fù)合物于細(xì)胞膜，并解除MOAP-1的分子內(nèi)抑制，使MOAP-1與BAX結(jié)合。凋亡效應(yīng)蛋白 KRAX的活化能增強(qiáng)RASSF1A與 MOAP-1的結(jié)合，抑制細(xì)胞生長。因此，RASSF1A通過MOAP-1和活化的 KRAX調(diào)節(jié)BAX 活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。Foley 等［19］發(fā)現(xiàn)，在TNF-α刺激作用下，MOAP-1與TNF-R1(腫瘤壞死因子受體1)結(jié)合并募集RASSF1A成為復(fù)合物，參與死亡受體依賴的凋亡途徑。RASSF1A與TNF-R1相互作用參與內(nèi)體運(yùn)輸，通過影響微管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性調(diào)節(jié)TNF-R1內(nèi)化。過表達(dá)RASSF1A能使乳腺癌MCF-7細(xì)胞(缺乏內(nèi)源性RASSF1A)通過死亡受體依賴途徑誘導(dǎo)凋亡［18］。而在人胚腎293T細(xì)胞，RASSF1A本身很少引起凋亡，但能顯著增加CNK1(connector enhancer of KSR)誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。CNK1是活化RAS所必需的一種多位點(diǎn)支架蛋白，能與MST1和MST2相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。敲除MST1羧基末端片段可調(diào)停MST1與RASSF1A的結(jié)合［20］。但必需指出的是，RASSF1A與凋亡通路有關(guān)的大部分?jǐn)?shù)據(jù)都是基于RASSF1A過表達(dá)轉(zhuǎn)染的研究，不一定能反映生理上的情況。

3 RASSF1A甲基化與腫瘤

在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化作用(DNA methyla-tion)是指在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransfeRASe，DNMT)的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸(SMA)提供甲基團(tuán)，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象。通常發(fā)生在5'-胞嘧啶位置上，這種DNA修飾方式是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，能夠在不改變DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因表達(dá)和保護(hù)DNA位點(diǎn)不受特定限制酶降解的作用。基因突變、缺失和(或)DNA啟動(dòng)子異常甲基化均可能導(dǎo)致RASSF1A失活。研究認(rèn)為，RASSF1A基因沉默的主要機(jī)制是啟動(dòng)子的異常甲基化。人類腫瘤中的RASSF1A表達(dá)缺失是一個(gè)普遍事件，至少在37種腫瘤中存在RASSF1A 啟動(dòng)子的異常甲基化［21-22］。Saelee 等［23］報(bào)道，86%的肝細(xì)胞癌存在RASSF1A甲基化，并與患者的預(yù)后和生存時(shí)間顯著相關(guān)。Malpeli等［24］發(fā)現(xiàn)，80%(16/20)的胰腺癌組織存在RASSF1A甲基化，且其基因表達(dá)沉默與甲基化狀態(tài)呈正相關(guān)。人類睪丸腫瘤中，RASSF1A基因78.75%的GC位點(diǎn)發(fā)生甲基化，且與基因抑制明顯相關(guān)，而正常睪丸組織則很少發(fā)生甲基化［25］。通常RASSF1A甲基化頻率在腫瘤細(xì)胞株要高于原發(fā)性腫瘤，這可能是由于在培養(yǎng)基中生長的腫瘤細(xì)胞重新發(fā)生甲基化。然而，用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理RASSF1A異常甲基化的腫瘤細(xì)胞株，可發(fā)現(xiàn)RASSF1A異常甲基化水平降低，并誘導(dǎo)RASSF1A基因的重新表達(dá)。

4 RASSF1A甲基化作為腫瘤生物標(biāo)記的應(yīng)用

RASSF1A過度甲基化可能成為一種腫瘤生物標(biāo)記，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。該基因在廣泛的人類腫瘤中均發(fā)生中等到高頻的甲基化，而正常組織幾乎不發(fā)生。因此，RASSF1A甲基化被考慮作為腫瘤的早期檢測(cè)和預(yù)后標(biāo)記，預(yù)測(cè)良性增生物惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)以及患者預(yù)后。

4.1 RASSF1A甲基化作為診斷標(biāo)記物 目前已證實(shí)，腫瘤患者血清中來自腫瘤細(xì)胞釋放的游離DNA含量升高，而RASSF1A甲基化作為肺癌診斷標(biāo)記的研究最多。34%的NSCLC組織和血清中存在RASSF1A異常甲基化。在很大比例的吸煙者上消化道、支氣管灌洗液、血漿和痰液中均檢測(cè)到RASSF1A甲基化，且與吸煙者每年的吸煙數(shù)量相關(guān)［26］。將RASSF1A甲基化分析與細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)等常規(guī)診斷方法相結(jié)合可提高診斷敏感性。例如，支氣管抽取物RASSF1A甲基化、組織學(xué)的肺癌檢測(cè)率分別僅為53%、59%，然而將檢測(cè)方法結(jié)合，診斷敏感性提高到81%［26］。另外，也有RASSF1A甲基化作為乳腺癌、膀胱癌和腎癌等腫瘤診斷標(biāo)記的報(bào)道。在乳腺癌患者中，65%的腫瘤組織存在RASSF1A甲基化，其相應(yīng)的血清中有56%同時(shí)存在RASSF1A甲基化，而未檢測(cè)到甲基化的腫瘤組織其血清中也未發(fā)生RASSF1A甲基化［27］。值得注意的是，在血清中檢測(cè)RASSF1A甲基化未取得理想效果。Murray等［28］在65%霍奇金淋巴瘤中檢測(cè)到RASSF1A甲基化，而相應(yīng)的血清中僅有4%發(fā)生甲基化。這些研究結(jié)果表明，可以在腫瘤患者的一系列體液中檢測(cè)到RASSF1A甲基化，與傳統(tǒng)的診斷方法相比其敏感性有很大提高。因此，RASSF1A甲基化可成為一種有用的早期診斷標(biāo)記，提供一種腫瘤診斷的新方法。

4.2 RASSF1A甲基化作為預(yù)后標(biāo)記物 RASSF1A過度甲基化可能預(yù)示患者生存率降低，在血管和胸膜受累的NSCLC患者中，RASSF1A甲基化與腫瘤低分化和患者的低生存率有關(guān)［29］。RASSF1A甲基化與患者開始吸煙的年齡、早期肺癌的復(fù)發(fā)和低生存率有關(guān)［30］，但也有報(bào)道RASSF1A甲基化與患者的生存率無關(guān)［31］。RASSF1A甲基化在惡性腫瘤預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值尚有待更進(jìn)一步的研究。

5 問題與展望

現(xiàn)已證實(shí)，啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致抑癌基因的表達(dá)沉默是人類腫瘤中抑癌基因失活的共同機(jī)制之一，并且可能成為一種有應(yīng)用前景的體液分子檢測(cè)新靶點(diǎn)。但目前RASSF1A甲基化研究尚處于探索階段，RASSF1A基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用以及RASSF1A啟動(dòng)子甲基化作為診斷早期腫瘤和判斷預(yù)后的生物標(biāo)記仍尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步研究。

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