黃連素對125I粒子放療肝癌的增敏作用與腫瘤血管形成影響的研究

王如華

肝臟是一個輻射敏感器官，其輻射致死劑量為60 Gy/6周，耐受劑量僅為30 Gy，而肝癌必須有超過40 Gy的吸收劑量才能得到較好的局部控制。由于肝臟的放射耐受量低于肝癌組織的放射治療劑量，故肝癌常規(guī)放療效果不佳。近年來，放射性125I粒子組織間植入治療肝癌以其簡便、易于操作、副作用小等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于臨床，但由于植入腫瘤后吸收劑量不均，劑量“冷點”處殘存的腫瘤細(xì)胞仍可導(dǎo)致復(fù)發(fā)，植入過多的粒子雖然能避免此缺憾，但同時也對肝臟造成較大損傷［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能增加放療敏感性［2-4］。本研究通過分組實驗，論證黃連素可否增強(qiáng)125I粒子的療效，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細(xì)胞株 雌性 BALB/c裸鼠40只(合格證:SCXK 京2009-0004)，SPF級，6～8周，體重18～20 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，于SPF級動物實驗室飼養(yǎng)。人肝癌HepG2細(xì)胞株(購于北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心)。

1.1.2 儀器與試劑 RM2145切片機(jī)(德國Lico公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，游標(biāo)卡尺(無錫錫工量具有限公司)，粒子植入設(shè)備(包括植入槍、穿刺針、撞針均由原子高科股份有限公司提供)，VEGF多克隆抗體、MVD及SP染色試劑(北京中杉公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司);黃連素(純度97%，四川省玉鑫藥業(yè)有限公司);活度 0MBq(0mCi)及活度 29.6MBq(0.8 mCi)的125I粒子(北京智博高科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號:2BS0908-13-01)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 將凍存于液氮中的人肝癌HepG2細(xì)胞復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，采取胰酶消化法培養(yǎng)，制成細(xì)胞濃度為1×107的單細(xì)胞懸液10 mL。于生物安全柜內(nèi)，用1 mL注射器取200 μL的單細(xì)胞懸液，以碘伏溶液消毒裸鼠右腹部皮膚，將細(xì)胞懸液接種于BALB/c裸鼠右腹部皮下。1周左右可陸續(xù)在接種小鼠的右腋下觸及結(jié)節(jié)，約10 d后成瘤，造模成功 39只，成功率97.5%，平均瘤徑 8.14 mm。

1.2.2 實驗分組和治療 將24只瘤徑約8 mm的裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。治療前將選取的實驗動物拍CT片，將CT圖像、125I粒子活度和擬計劃劑量輸入三維治療計劃系統(tǒng)(TPS)，由TPS確定應(yīng)植入的125I粒子數(shù)量和布陣。生物安全柜內(nèi)分別取出各組裸鼠，氯胺酮+咪唑安定(1∶1)腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺板上，75%乙醇消毒。根據(jù)TPS的要求，在相應(yīng)位置植入粒子。A組:植入2?？招牧２⒚刻旃辔高m量生理鹽水;B組:植入2?？招牧２?5 mg·kg－1/d灌胃黃連素溶液;C組:植入2粒125I粒子并每天灌胃適量生理鹽水，D組:植入2粒125I粒子并按45 mg·kg－1/d灌胃黃連素溶液;植入結(jié)束后即刻行CT顯像，驗證布源與治療計劃一致，然后將小鼠放回鼠籠，注意保暖，防止擠壓，待小鼠蘇醒后，送返動物房飼養(yǎng)、觀察。

1.2.3 觀察指標(biāo)和方法 (1)小鼠存活率:連續(xù)觀察28 d，記錄各組存活鼠數(shù);(2)腫瘤體積變化及其抑制率:對各組小鼠每隔4天用游標(biāo)卡尺測量1次腫瘤體積大小，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑(a)及與之垂直的最寬徑(b)，利用公式:腫瘤體積(TV)=a×b2/2，計算腫瘤體積，并觀察瘤體有無破潰、壞死及粒子脫落，同時根據(jù)公式:腫瘤體積抑制率=［(對照組平均體積－治療組平均體積)/對照組平均體積］×100%，計算腫瘤體積抑制率。

1.2.4 增敏系數(shù)(EF)的計算 EF=NGD/AGD，其中NGD(normalized growth delay)為規(guī)格化腫瘤生長延緩時間，AGD(absolute growth delay)為絕對腫瘤生長延緩時間;NGD=TD－TB(TD為D組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TB為B組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))。AGD=TC－TA(TC為C組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TA為A組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))。TA、TB、TC、TD的算法為:先將倍增后的體積定位在生長曲線上的相鄰兩個點之間，求出兩點的直線方程，代入倍增后的體積具體數(shù)值即可算出。EF＞1提示有放射增敏效應(yīng)。

1.2.5 石蠟切片制備及VEGF、MVD免疫組化染色新鮮腫瘤標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，每例標(biāo)本均取相鄰組織4 μm厚連續(xù)切片，每例取2張切片，分別免疫組化染色。染色步驟參照SP試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色或棕褐色者為VEGF表達(dá)陽性，采用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)采樣測量3處，計算單位面積下陽性染色區(qū)域面積;MVD檢測用CD34抗體標(biāo)志瘤體內(nèi)微血管，根據(jù)CD34染色陽性細(xì)胞，計數(shù)MVD平均數(shù)目。

1.2.6 數(shù)理統(tǒng)計 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時間點數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，本研究的檢驗顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠存活率

觀察28 d，A組小鼠存活4只(66.7%)，B組小鼠存活5只(83.3%)，C、D組小鼠100%存活。小鼠多死于腫瘤轉(zhuǎn)移或腹水造成的惡病質(zhì)。

2.2 腫瘤體積測量

實驗開始后，各組的移植瘤生長速度明顯，但是C組、D組在實驗第8天后腫瘤體積處于平臺期，增長緩慢，而A、B組的裸鼠皮下移植瘤相對腫瘤體積生長較快。經(jīng)計算所得，各治療組小鼠腫瘤的平均體積明顯小于對照組(P＜0.01)，B、C與D組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，D組腫瘤體積抑制率高于B、C組，具體見表1、圖1。

表1 各組治療前后腫瘤體積變化情況及抑瘤率

表1 各組治療前后腫瘤體積變化情況及抑瘤率

注:與 A 組比較，＊＊ P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05;與 D 組比較，ΔΔP ＜0.01，ΔP ＜0.05

組別 例數(shù) 0 d(mm3) 28 d(mm3) 腫瘤體積抑制率(%)A組4 143.26 ±20.12 1 202.13 ±139.73 －B 組 5 139.38 ±13.87 994.29 ±61.50*ΔΔ 17.310＊＊ΔΔ C 組 6 132.94 ±18.34 391.04 ±19.12＊＊Δ 67.479＊＊Δ D 組 6 134.27 ±17.84 269.10 ±19.26＊＊ 77.619＊＊

圖1 各組裸鼠治療后腫瘤生長情況

2.3 增敏系數(shù)(EF)

D組的生長延緩時間最長，EF=1.84＞1，提示黃連素對125I粒子的放療有增敏作用，具體見表2。

表2 增敏系數(shù)計算表

2.4 各組腫瘤組織中VEGF及微血管密度(MVD)免疫組化表達(dá)

根據(jù)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)分析。與A組比較，B組雖能下調(diào)VEGF的表達(dá)，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而C組能顯著下調(diào)VEGF表達(dá)(P＜0.01)，且D組下調(diào)更明顯，與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示黃連素能夠增強(qiáng)125I粒子下調(diào)VEGF表達(dá)的能力。各治療組的MVD數(shù)顯著低于A組(P＜0.05)，而D組的MVD數(shù)相對比B、C組更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明黃連素聯(lián)合125I粒子組中的MVD的表達(dá)最少，其結(jié)果見表3。

表3 各組荷瘤鼠腫瘤組織中VEGF及MVD的表達(dá)

表3 各組荷瘤鼠腫瘤組織中VEGF及MVD的表達(dá)

注:與 A 組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05;與 D 組比較，ΔΔP ＜0.01，ΔP ＜0.05。

組別 例數(shù) VEGF表達(dá)量(×107)MVD A組43.31 ±0.77 23.91 ±2.28 B 組 5 2.96 ±0.34ΔΔ 18.60 ±1.56*ΔΔ C 組 6 2.13 ±0.51＊＊Δ 11.07 ±1.74＊＊Δ D 組 6 1.74 ±0.21＊＊ 7.19 ±1.32＊＊

3 討論

實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管生成［5］。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1～2 mm3時需要依靠新生血管來獲取營養(yǎng)及氧以維持腫瘤的迅速生長，否則腫瘤組織將保持休眠狀態(tài)或發(fā)生退化。早在20世紀(jì)70年代，F(xiàn)olkman等依據(jù)大量的實驗證據(jù)，提出腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的活性和專屬性最強(qiáng)的血管生成因子［6］，廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，在腫瘤血管形成機(jī)制方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，與肝癌的形成、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)［7-9］，所以我們選擇了VEGF做為研究的主要目標(biāo)，MVD為評價腫瘤組織新生血管的客觀指標(biāo)。本實驗中分別觀察了黃連素、125I粒子、125I粒子聯(lián)合黃連素對荷人肝癌移植瘤的治療作用，結(jié)果提示，治療組均能降低VEGF表達(dá)和腫瘤MVD，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而且以125I粒子聯(lián)合黃連素組抑制效果最佳，與黃連素組和125I粒子組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另在本研究的預(yù)試驗中，我們先對不同劑量黃連素的 EF進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)30 mg·kg－1/d、45 mg·kg－1/d 和60 mg·kg－1/d 3 個劑量的 EF 分別為 0.89、1.84、1.91，證明黃連素劑量為30 mg·kg－1/d(EF ＜1)時無增敏作用，而 45 mg·kg－1/d和60 mg·kg－1/d的 EF 相差不大，考慮到大劑量的黃連素可能存在的不良反應(yīng)，故將研究劑量定為 45 mg·kg－1/d。

實體瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于一定的條件。首先，腫瘤性脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能異常能使瘤組織血液灌流不暢而致氧供不足及代謝障礙，低氧可在多方面影響腫瘤的發(fā)展，如促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、使腫瘤對放療不敏感等?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連素具有抗血小板聚集作用，這一特性將會改善腫瘤微環(huán)境的血流供應(yīng)情況，減少對射線抗拒的乏氧細(xì)胞，從而增加腫瘤對放射線的殺傷敏感性。此外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)黃連素通過誘導(dǎo)激活細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑中一個非常重要的蛋白酶Caspase-3及抑制腫瘤發(fā)生過程中的一個重要轉(zhuǎn)錄因子AP-1，而對人肝癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［4］。同時，黃連素不但能與DNA結(jié)合導(dǎo)致DNA形態(tài)發(fā)生變化，還對RNA和蛋白質(zhì)的生物合成具有更強(qiáng)的抑制作用。其結(jié)果使得DNA鏈變得比較“脆弱”，進(jìn)而提高了放射敏感性;另一方面黃連素還對潛在致死損傷修復(fù)有較強(qiáng)的抑制作用，從而改變輻射損傷，起到放射增敏作用。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以增強(qiáng)125I粒子近距離持續(xù)放射作用，通過下調(diào)腫瘤組織中VEGF的表達(dá)來抑制腫瘤新生血管的生成，從而起到增敏作用。黃連素是否還能通過其他途徑增加125I粒子放療效果，還有待進(jìn)一步研究。

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