神經(jīng)生長因子治療腦出血的作用機制

倪厚杰（綜述） 唐洲平（審校）

腦出血（ICH）是常見的腦血管疾病，隨著老齡化社會的到來，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，據(jù)統(tǒng)計占急性腦血管病的20%～30%，而且致殘率較高［1］。因此如何有效治療ICH，最大限度促進受損神經(jīng)功能的恢復(fù)一直是眾多學(xué)者關(guān)注的焦點之一。NGF是20世紀50年代初由Levi-Montalcini在小鼠肉瘤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個神經(jīng)營養(yǎng)因子［2］。它是一種由α、β及γ3種不同類型的蛋白質(zhì)組成的三維空間結(jié)構(gòu)復(fù)合物，分子量為140000左右，是一類由神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織或膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的，能促進中樞和外周神經(jīng)分化、生長和存活的活性蛋白質(zhì)，它們在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和正常的生理功能維持中起著重要作用［3］。近些年來，多項研究表明NGF對ICH的神經(jīng)功能的恢復(fù)有著積極促進作用，現(xiàn)將NGF對ICH的作用機制綜述如下：

1 神經(jīng)生長因子對腦出血的作用機制

1.1 腦出血后NGF具有促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（NSCs）的激活和增殖、遷移及分化的作用

神經(jīng)干細胞（NSCs）因具有高度自我更新能力、多潛能分化、低免疫原和遷移功能等特性［4］。研究表明NSCs存在于成年動物CNS的廣泛區(qū)域，在成年哺乳動物的腦室下區(qū)、海馬齒狀回、紋狀體、大腦皮質(zhì)、脊髓中央管等區(qū)域均證實有NSCs存在［5］。但在正常生理狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量有限的NSCs僅以靜息狀態(tài)存在。

腦損傷后NGF可促進內(nèi)源性NSCs增殖，保護受損神經(jīng)元，促進神經(jīng)纖維再生，誘導(dǎo)軸突發(fā)育，從而使受損的神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。

腦損傷后增殖只有在新生細胞能夠到達細胞缺失的腦區(qū)才是有意義的，對此已有研究通過觀察到新生細胞能夠遷移出增殖區(qū)，而間接證實生長因子中的NGF可以促進內(nèi)源性NSCs的遷移。影響遷移的幾種相關(guān)因素：生長因子中的NGF可以促進內(nèi)源性NSCs的遷移，它僅出現(xiàn)在遷移期的神經(jīng)前體細胞，其受體erb表達于遷移期的放射狀膠質(zhì)細胞，阻斷受體erb后神經(jīng)前體細胞的遷移受到抑制。

許多神經(jīng)營養(yǎng)因子可以通過與NSCs上特異受體的結(jié)合激活細胞內(nèi)信號促使細胞分化。

近年研究表明NSCs在體外存活和分化受諸多因素調(diào)控［6］，一類是內(nèi)部因素，即基因調(diào)控，包括Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、螺旋一環(huán)一螺旋（BHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族、PTEN基因、Numb基因、Nurrl核轉(zhuǎn)錄因子等；另一類就是外部因素，表皮生長因子、成纖維細胞生長因子家族、腦源性生長因子、NGF、神經(jīng)營養(yǎng)素3、白細胞抑制因子、血小板源性生長因子等。在對諸多影響NSCs存活分化的外部因素的研究中，尤以對NGF的認識和研究較早也較全面，有實驗證明NGF可以促進NSCs存活分化的潛能［7，8］且能夠促進誘導(dǎo)NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化。在通過對此NSCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，證實了NGF可以促進NSCs分化為神經(jīng)元這一結(jié)論。

烏優(yōu)圖［9］等在觀察NSCs向神經(jīng)元分化過程中神經(jīng)生長因子對軸突生長的作用，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組單個神經(jīng)元的平均軸突數(shù)量和最長軸突平均長度均遠大于對照組，說明NGF不但對神經(jīng)元已有的軸突具有促進其出芽、分枝和生長的功能［10，11］，而且在NSCs向神經(jīng)元分化過程中或者初級神經(jīng)元軸突形成過程中還能夠促進那些未長出突起的神經(jīng)細胞向極化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并增加生長錐的生成，最終增加分化后神經(jīng)元突起數(shù)量。該實驗研究證明NGF可以促進NSCs向神經(jīng)元分化，且對神經(jīng)突起形成和生長均有明顯的促進作用。

周政等建立的大鼠流體腦創(chuàng)傷模型，采用免疫細胞化學(xué)及圖像分析等方法，觀察腦創(chuàng)傷后非NGF處理組和NGF處理組Nestin蛋白表達的變化，結(jié)果顯示外源性NGF能明顯促進腦創(chuàng)傷后Nestin陽性細胞數(shù)量的增加，而Nestin是顱內(nèi)NSCs的的標志物［12］。

以上諸多研究均說明NGF在腦損傷后具有激活內(nèi)源性NSCs，并促進其增殖、遷移以及分化的作用。

1.2 NGF能抑制灶周神經(jīng)元的凋亡，促進血腫灶周神經(jīng)元的軸突生長和修復(fù)

凋亡是受特定基因經(jīng)特定信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控的細胞死亡的一種形式。近年大量的研究表明，神經(jīng)細胞凋亡參與了神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的過程。而Qureshi等的臨床研究通過外科手術(shù)取血腫周邊組織亦發(fā)現(xiàn)凋亡的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，亦證實血腫周邊組織存在神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象［13］。Gong研究報道也證實細胞凋亡在腦出血后的神經(jīng)元脫失中有重要的病理生理作用，出血后腦損傷過程中細胞凋亡呈動態(tài)性變化［14］。劉懷軍等研究報道用犬腦內(nèi)注入非肝素化的自體動脈血建立實驗性ICH動物模型，結(jié)果證實ICH早期血腫周邊組織中凋亡的神經(jīng)細胞占37%［15］。常煥顯等通過大鼠ICH模型研究顯示，出血灶周圍腦組織多種細胞發(fā)生凋亡［16］。從諸多研究均已證實ICH血腫周圍存在大量神經(jīng)細胞凋亡。

尼澤榮通過實驗觀察到NGF可提高培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，除去培養(yǎng)液中的NGF可引起30%～50%的細胞死亡，除去NGF后培養(yǎng)的神經(jīng)元中C－jun、c-fos細胞周期素D1、cmyb等誘導(dǎo)細胞凋亡的基因增加，而fra-1、Rb、bc1-2等抑制細胞凋亡的基因表達下降［17］。常煥顯通過大鼠ICH模型研究發(fā)現(xiàn)，給予 NGF干預(yù)后可以下調(diào)Caspase-3（Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋自酶）的表達，抑制大鼠腦出血后的細胞凋亡、促進神經(jīng)修復(fù)與再生的作用［16］。

這些實驗性研究都表明，NGF對神經(jīng)元的保護作用可能部分是通過阻抑神經(jīng)元發(fā)生凋亡的過程來實現(xiàn)的，尤其是在損傷后引起的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要的作用。

NGF對ICH受損神經(jīng)元有修復(fù)作用。有學(xué)者認為，神經(jīng)損傷后靶源性NGF先與雪旺氏細胞表面的低親和力受體結(jié)合，并與其他一些與軸突再生有關(guān)的物質(zhì)如層粘蛋白、纖粘蛋白等共同作用，在再生軸突前方擴散形成一個濃度梯度，引導(dǎo)生長錐沿SCs膜表面向前生長與靶細胞建立聯(lián)系［18］。經(jīng)過第二信使體系的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，對靶細胞的基因表達進行調(diào)控而發(fā)揮其生物效應(yīng)，最終使再生軸突成熟及髓鞘化。NGF還能提高神經(jīng)元內(nèi)cAMP水平，激活PKA，使Rho磷酸化而失活，阻斷髓鞘對軸突生長的抑制作用［19］。同時，NGF與神經(jīng)末梢上相應(yīng)的NGF受體結(jié)合后進入軸突，再經(jīng)逆行軸漿轉(zhuǎn)運至胞體，在某些過程中引起一系列的生物效應(yīng)，如誘導(dǎo)突起生長、修復(fù)損傷神經(jīng)、促進某些蛋白和酶的合成等。

NGF還能夠抑制腦損傷后興奮性氨基酸的升高效應(yīng)，從而間接抑制了興奮性氨基酸作用于NMDA受體所致的Ca2＋內(nèi)流進而抑制了Ca2＋對NOS的激活；NGF可通過抑制急性腦損傷后NOS的升高，減少了NO的釋放抑制了一氧化氮的毒性作用，從而保護了腦神經(jīng)元，這可能是NGF對腦損傷保護作用的機制之一。另外，NGF能增加過氧化氫酶、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等自由基清除劑的活性；對細胞內(nèi)Ca2＋的濃度也有很好的穩(wěn)定作用。

Chiaretti研究發(fā)現(xiàn)，在腦室內(nèi)連續(xù)注射NGF可明顯改善重型顱腦損傷嬰兒的腦功能，減少腦軟化灶，改善腦組織局部灌注［20］；Mashayekhi等向大鼠腦室內(nèi)注入NGF抗體，結(jié)果可使皮質(zhì)神經(jīng)元死亡增加、皮質(zhì)變薄、情感和認知功能明顯受損，這說明NGF在維持神經(jīng)元存活及其功能中起著至關(guān)重要的作用［21］。

由此可見，NGF改善腦出血灶周神經(jīng)元生存環(huán)境，抑制其凋亡，促使損傷的神經(jīng)細胞修復(fù)，神經(jīng)軸突生長，最終達到生理功能的重建。

1.3 NGF促進灶周新生血管的生成

研究發(fā)現(xiàn)NGF不僅可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達間接地促進血管形成，NGF還具有直接促進血管形成的作用［22］。

NGF與血管內(nèi)皮細胞的相互作用。Tanaka等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠主動脈內(nèi)皮細胞可產(chǎn)生并釋放NGF，從而確認血管內(nèi)皮細胞是NGF的又一重要來源［23］。Park等發(fā)現(xiàn)NGF在插人體內(nèi)的基質(zhì)膠上可促進新血管形成，但對于敲除MMP-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的小鼠則不能顯現(xiàn)出此作用［24］。數(shù)據(jù)顯示 NGF刺激內(nèi)皮細胞生長是通過MMP-2的作用而產(chǎn)生的，經(jīng)P13K／TrkA（phosphatidylinositol 3-kinase，P13K）信號途徑和 AP-2轉(zhuǎn)錄因子，通過此信號通路引起血管生成。

于一凡等通過實驗表明NGF增強了腦缺血后再灌注大鼠紋皮質(zhì)血管c-Fos蛋白表達，促進新生血管形成，保護缺血神經(jīng)元［25］。周宏等采用免疫組化法檢測NGF對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后不同時間內(nèi)巢蛋白及VEGF表達的影響，證實給予外源性NGF后可以促進VEGF的表達上調(diào)，腦毛細血管新生［26］。因此，可以推測NGF上調(diào)VEGF的表達是促進受損腦組織新生血管的形成，利于神經(jīng)修復(fù)的作用機制之一。

Calza等通過對新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)（superior cervical ganglia，SCG）的研究發(fā)現(xiàn)，NGF不僅可促進SCG內(nèi)神經(jīng)元的發(fā)育，而且SCG內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞肥大、增生，血管床面積增大，進一步研究發(fā)現(xiàn)SCG內(nèi)的VEGF表達也增多［27］。證實了NGF促進血管形成的機制是通過促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移來實現(xiàn)的。也有研究顯示NGF促進新血管形成的機制在于NGF能促進神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2＋向細胞外釋放，Ca2＋外流導(dǎo)致神經(jīng)細胞緊張性增強，興奮性降低，使血管擴張增強，從而加大血流量［28］。因此，NGF也可促進神經(jīng)組織的血管形成［29］。

2 問題與展望

ICH的病死率及致殘率均較高，病死率在30%～40%左右，75%存活患者遺留有不同程度的殘疾。如何有效的降低ICH患者的病死率及致殘率是一直都是國內(nèi)外專家研究的課題。NGF是人體神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，其在促進神經(jīng)細胞分裂增殖、誘導(dǎo)軸突生長和形成突觸網(wǎng)絡(luò)三個階段中發(fā)揮著重要作用。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時內(nèi)源性NGF在腦內(nèi)含量低微，及時補充外源性NGF能有效對受損神經(jīng)元實施全面和持久的神經(jīng)保護作用，促進神經(jīng)系統(tǒng)功能的修復(fù)。

雖然近幾十年來，NGF的實驗研究一直備受關(guān)注，人們對其生物有效性不斷產(chǎn)生新的認識，許多觀點已形成共識，即能從多個方面促進受損腦組織神經(jīng)功能恢復(fù)，但是NGF被廣泛運用到臨床治療仍有爭議。存在的問題有如下幾個方面：

2.1 BBB對NGF的通透性問題

NGF的分子量是其他神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTF）的5倍以上［30］，屬于大分子蛋白，在血液循環(huán)中的NGF不能有效透過BBB，即便有微量通過血流進人中樞神經(jīng)系統(tǒng)卻達不到有效劑量。此外，經(jīng)靜脈給藥后NGF這一陰離子分子在血流中會被迅速清除［31］。趙紅梅等報道通過外周系統(tǒng)給藥（主要包括靜脈滴注、肌肉注射、皮下注射等）、側(cè)腦室及鞘內(nèi)注射以及經(jīng)鼻給藥，但其療效均欠佳［32］。劉懷軍等研究利用外源性NGF立體定向?qū)胙[灶周區(qū)，通過刺激顱內(nèi)內(nèi)源性NSCs再生、分化和遷徙的機制來促進血腫灶周神經(jīng)功能的修復(fù)，取得令人鼓舞的效果，但這些給藥途徑無法得到一致的認可［33］。

2.2 NGF的安全性問題

NGF既然能激活顱內(nèi)NSCs，引起其增殖、分化、遷移，那么NGF是否具有成瘤性，在安全上受質(zhì)疑。國內(nèi)外所提取的NGF均來自動物，對人體是否有抗原性［34］。NGF生物學(xué)效應(yīng)特別是非神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)的研究仍比較凌亂，亟待深入研究。腦損傷后NGF及其受體的時空分布及其產(chǎn)生的保護機制尚無定論［34］。

但我們相信隨著對NGF的來源、制劑、疾病動物模型、臨床試驗、給藥途徑、療效評估等系統(tǒng)的更深入研究，其作用機制被更全面地闡明，尤其是基因工程技術(shù)的應(yīng)用、量效關(guān)系的確立，對NGF進行載體、分子重構(gòu)以及控釋系統(tǒng)等特殊處理后，NGF應(yīng)具備以下幾個優(yōu)點：（1）NGF更有效地透過BBB，能被釋放于體內(nèi)特定區(qū)域；（2）能較長時間穩(wěn)定釋放；（3）生物相容性好，能自行降解，且降解產(chǎn)物無任何毒副作用；（4）使用方便，成本低廉。最終，NGF將會被更科學(xué)更安全更有效地應(yīng)用于臨床疾病的治療中。

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