MiRNAs在惡性腫瘤診斷及治療研究中的新進(jìn)展

劉雅歆， 程靜新

miRNAs是一類大小約19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNAs，廣泛存在于真核生物中。近年來(lái)，miRNAs與腫瘤的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)，成為21世紀(jì)的“明星分子”。不少研究結(jié)果表明，miRNAs既可以是癌基因，也可以是抑癌基因，有望成為惡性腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物及治療的藥物靶點(diǎn)。本文現(xiàn)就miRNAs在惡性腫瘤診斷及治療方面的研究新進(jìn)展做一綜述。

1 miRNAs的特點(diǎn)

1.1 miRNAs的發(fā)現(xiàn) 1993年 Lee等［1］在研究線蟲(chóng)發(fā)育缺陷時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了lin-4，2000年Reinhart等在對(duì)線蟲(chóng)的發(fā)育調(diào)控研究中又發(fā)現(xiàn)了let-7，之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了大量類似lin-4的小RNA基因，被統(tǒng)一命名為miRNA。miRNAs廣泛存在于真核生物中，其本身不具有開(kāi)放閱讀框(ORF)，成熟的miRNAs，5'端有一個(gè)磷酸基團(tuán)(－ HPO4)，3'端為羥基(－OH)。據(jù)估計(jì)，人類基因組中miRNAs的種類約有1 000種，近30%的人類基因受miRNAs的調(diào)控。越來(lái)越多的證據(jù)證明，miRNAs在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、生殖以及腫瘤發(fā)病機(jī)制中都具有一定的調(diào)控作用。超過(guò)50%的人類miRNAs基因定位于腫瘤相關(guān)的區(qū)域或脆弱區(qū)域［2］。

1.2 miRNAs的生物合成 目前認(rèn)為編碼miRNA的基因首先在核糖核苷酸酶Ⅱ(ribonucleaseⅡ，RNaseⅡ)的作用下在胞核內(nèi)形成最初的miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA在Drosha酶的作用下形成發(fā)夾狀前體 miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在Ran-GTP和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)運(yùn)出核進(jìn)入胞漿，隨后在Dicer酶的剪切作用下切割成雙鏈miRNA，其中的一條RNA鏈進(jìn)入核蛋白復(fù)合體，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，這條單鏈 RNA稱為成熟miRNA(mature-miRNA)，而另一條RNA單鏈則被降解［3-4］。目前普遍認(rèn)為miRNA主要通過(guò)兩種機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)節(jié):一種是mRNA的降解，另一種是翻譯抑制。當(dāng)miRNA和編碼蛋白的mRNA的3'UTR(3'非編碼區(qū))完全或幾乎完全配對(duì)時(shí)，RISC阻斷mRNA的翻譯，并導(dǎo)致mRNA的降解，這種機(jī)制多見(jiàn)于植物中［5］。然而，大多數(shù)情況下miRNA并不導(dǎo)致靶mRNA降解，而是通過(guò)不完全的堿基配對(duì)與mRNA在一個(gè)類似于或等同于RNA干擾途徑中使用的RISC復(fù)合物中，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因翻譯。通過(guò)這種機(jī)制發(fā)揮作用的miRNA僅降低其靶基因的蛋白表達(dá)水平，靶基因的mRNA水平幾乎不發(fā)生改變［6-8］。

1.3 miRNA常用檢測(cè)方法 由于成熟的miRNAs很短，在細(xì)胞中的表達(dá)量不高，所以對(duì)于miRNA的檢測(cè)完全不同于mRNA、rRNA等檢測(cè)。目前關(guān)于miRNA常用的檢測(cè)方法有RNA印跡分析法(Northern blot)、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR，RTPCR)和微陣列芯片等。(1)Northern blot是最經(jīng)典的真核生物RNA檢測(cè)方法，常用來(lái)評(píng)價(jià)其他miRNA檢測(cè)方法的可靠性，優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)顯示被檢測(cè)miRNA相對(duì)分子質(zhì)量和豐度兩個(gè)方面的信息，這是其它實(shí)驗(yàn)方法無(wú)法比擬的;缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性增加(與RNA雜交的特異性探針都是放射性元素標(biāo)記的)。(2)RT-PCR可以滿足大多數(shù)miRNA在組織及細(xì)胞中表達(dá)水平的研究，優(yōu)點(diǎn)是特異性及靈敏度高;缺點(diǎn)在于價(jià)格昂貴，在篩選miRNA的過(guò)程中無(wú)法做到同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)樣品。(3)微陣列芯片(microarray)可以在短時(shí)間內(nèi)快速、高通量的分析大量的生物分子，所需樣本量小，目前被廣泛用于初篩;缺點(diǎn)是特異性及靈敏度不高。所以檢測(cè)miRNA需要結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)綜合考慮。

2 miRNA與腫瘤診斷

隨著腫瘤總發(fā)病率持續(xù)上升，針對(duì)高發(fā)惡性腫瘤開(kāi)展篩查和早期診斷工作，選擇一種特異度、靈敏度高的早期診斷標(biāo)記物顯得尤為重要。隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為miRNA很有可能作為惡性腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。肺癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中以鱗癌最為常見(jiàn)。Raponi等［9］證明 miR-146b診斷鱗癌具有比較高的準(zhǔn)確性。Lebanony等［10］發(fā)現(xiàn)miR-205可作為診斷鱗癌的生物標(biāo)記物，在癌組織中具有極高的特異性和敏感性。乳腺癌是危害女性健康的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，Van等［11］和Rodríguez-González等［12］鑒定了 13 種 miRNAs 在炎性乳腺癌和非炎性乳腺癌組織中的表達(dá)情況，其中4種miRNAs的靶基因與預(yù)測(cè)相同，3種miRNAs在炎性乳腺癌中過(guò)表達(dá)，9種miRNAs在炎性乳腺癌中低表達(dá)，為乳腺癌的診斷提供了新的重要依據(jù)。Chan等［13］在胃癌組織與正常組織miR-21的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，92%(34/37)的胃癌樣本中miR-21過(guò)表達(dá)，但miR-21的過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后不相關(guān)，不反映胃癌復(fù)發(fā)與預(yù)后的情況。Guo等［14］報(bào)道了11種在胃癌中顯著高表達(dá)的miRNAs，提示這些miRNAs很可能在胃癌的早期診斷中發(fā)揮作用。Wang等［15］在對(duì)98例結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，癌組織中miR-31的表達(dá)明顯高于正常組織，miR-145在結(jié)腸癌和直腸癌中都呈下調(diào)表達(dá)，而miR-143只在結(jié)腸癌中下調(diào)。此研究不僅有助于直結(jié)腸癌的診斷，并且對(duì)結(jié)腸癌和直腸癌也有一定的區(qū)分意義。Ng等［16］通過(guò)研究證實(shí)血漿中的miR-92可以作為篩查結(jié)直腸癌的重要分子標(biāo)志物。Schmitz等［17］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)miR-181b和miR-21在結(jié)腸腺瘤中呈高表達(dá)，在結(jié)腸息肉中的表達(dá)位居其次，而在正常結(jié)腸黏膜中的表達(dá)最少。Li等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中明顯低表達(dá)的miR-126可以抑制腫瘤細(xì)胞的周期，在結(jié)腸癌的診斷和治療中可作為一種抑癌基因發(fā)揮作用。Guo等［19］利用miRNAs微陣列芯片技術(shù)對(duì)食管癌組織進(jìn)行了miRNAs表達(dá)譜分析，得出能夠區(qū)分惡性和鄰近正常組織的7種miRNAs，這些miRNAs將有望成為食管癌重要的診斷性分子標(biāo)志物。

3 miRNAs與腫瘤治療

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，靶向治療在腫瘤藥物治療方面迅速興起。miRNAs即可以作為癌基因促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生與生長(zhǎng)，又可以作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。大量研究結(jié)果提示miRNAs是包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的藥物治療靶點(diǎn)，所以通過(guò)抑制作為癌基因的miRNAs，或者導(dǎo)入作為抑癌基因的miRNAs來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Let-7是目前研究最為廣泛的miRNAs之一，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，普遍認(rèn)為其功能抑制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Fei等［20］報(bào)道運(yùn)用anti-miRNA技術(shù)，在A549細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染anti-miR-21、anti-miR-16和anti-miR-181a后，細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制。Weiss等［21］研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中經(jīng)常發(fā)生miR-128b雜合性缺失，miR-128b以表皮生長(zhǎng)因子受體為靶基因參與調(diào)控其在NSCLC的表達(dá)水平，與患者對(duì)吉非替尼的反應(yīng)及生存有關(guān)。Pan等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞株中miR-328調(diào)控乳腺癌耐藥基因ABCG表達(dá)并增加耐藥細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的敏感性。在對(duì)雌激素拮抗劑耐藥的乳腺癌細(xì)胞株研究中，Xin等［23］進(jìn)行了 miRNAs和 mRNAs雙重芯片的對(duì)照研究，結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌對(duì)雌激素拮抗劑耐藥與miRNAs表達(dá)密切相關(guān)，并且預(yù)測(cè)的靶基因是耐藥相關(guān)信號(hào)通路中的重要成員。Kong等［24］研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)的 miR-155通過(guò)抑制FOXO3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤存活與增殖，并降低腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。Xia等［25］在胃癌MDR細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)miR-15b和miR-16都表達(dá)下調(diào)，當(dāng)上調(diào)其表達(dá)時(shí)miR-15b和miR-16以BCL-2為靶基因誘導(dǎo)凋亡，并恢復(fù)耐藥細(xì)胞的化療敏感性。Ji等［26］研究發(fā)現(xiàn)miR-34能恢復(fù)P53缺陷的胃癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感性，通過(guò)靶基因BCL-2誘導(dǎo)凋亡，從而恢復(fù) P53的功能。Fujita等［27］研究發(fā)現(xiàn)miR-34a可以下調(diào)P53基因缺陷的前列腺癌細(xì)胞STRT1基因的表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯以及生長(zhǎng)抑制，恢復(fù)喜樹(shù)堿的化療敏感性。Yang等［28］研究發(fā)現(xiàn)用AKT抑制劑或直接抑制miR-214對(duì)PTEN的靶調(diào)節(jié)作用，可以降低miR-214通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞的生存率和對(duì)順鉑的抵抗性，此研究結(jié)果提示這些方法可以應(yīng)用到耐藥性卵巢癌的治療中，以增加卵巢癌患者對(duì)化療藥物的敏感性。Zhu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，miR-451可以上調(diào)MDR1的表達(dá)從而增加卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性。Sorrentino等［30］研究發(fā)現(xiàn)，miR-335的下調(diào)與卵巢癌的化療耐藥性有關(guān)。Boren等［31］研究發(fā)現(xiàn)miR-106a的靶基因MAP4與卵巢癌對(duì)紫杉醇敏感性有關(guān);miR-431的靶基因VIM與雌激素受體陽(yáng)性的卵巢癌患者對(duì)激素治療的反應(yīng)性有關(guān);miR-21的靶基因KLF5與P53基因獨(dú)立凋亡通路有關(guān)，其上調(diào)能夠增加癌細(xì)胞的化療藥物耐藥性。Yao等［32］在宮頸癌HeLa細(xì)胞的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21可以明顯抑制癌細(xì)胞的增殖，是通過(guò)上調(diào)腫瘤抑制基因PDCD4引起的，表明miR-21是宮頸癌的抑癌基因，并且可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。Lee等［33］對(duì)一些表達(dá)差異的miRNAs與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移及化療敏感性之間的關(guān)系做了進(jìn)一步的研究，在31例早期浸潤(rùn)性宮頸鱗癌中，未發(fā)現(xiàn)miRNAs與宮頸癌的臨床分期、腫瘤大小及復(fù)發(fā)相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)miR-127在淋巴轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)顯著升高(P=0.006)，因此推測(cè)miR-127可能是浸潤(rùn)性宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物;其同時(shí)將反義miR-199a轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞株(SiHa和ME180)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，而順鉑聯(lián)合反義miR-199a，對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用更明顯，并且存在著劑量效應(yīng)關(guān)系，認(rèn)為順鉑引起的DNA損傷可能增強(qiáng)反義miR-199a抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，miR-199a可能是宮頸癌治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

miRNA這個(gè)21世紀(jì)最耀眼的分子，目前在惡性腫瘤中發(fā)揮的作用還未完全闡明，仍需進(jìn)一步深入研究，把miRNA運(yùn)用到腫瘤的診斷、治療將會(huì)是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。需要對(duì)miRNAs發(fā)生改變的基因進(jìn)行全基因組的分析;對(duì)人類不同腫瘤中的拷貝數(shù)的改變的識(shí)別;對(duì)腫瘤抑制基因或者是致癌miRNAs的推定等［34］。隨著研究的不斷進(jìn)展，miRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的角色將會(huì)更加明了，這類非編碼單鏈小分子RNA的功能、作用機(jī)制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等將會(huì)更加明確，miRNA在惡性腫瘤診斷、治療方面將會(huì)發(fā)揮更大的價(jià)值，為惡性腫瘤的綜合防治發(fā)揮不可估量的作用。

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