ω-芋螺毒素研究進(jìn)展

左艷敏王筱婧王東興錢秋玉程遠(yuǎn)國

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院263臨床部藥劑科，101149；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所藥物研究室，100071)

芋螺毒素(Conotoxins)是自海洋腹足綱軟體動(dòng)物芋螺(Conus)中得到的一類具有生物活性的肽類毒素[1]。我國約有近百余種芋螺分布，集中在南海、北部灣和臺(tái)灣海域，其中每種芋螺的毒液中均含有百余種不同的活性多肽即芋螺毒素，且不同種的芋螺所含的芋螺毒素也各不相同，因此至少存在5萬多種芋螺毒素。芋螺毒素可引起動(dòng)物出現(xiàn)驚厥、顫抖甚至麻痹死亡。迄今為止，已經(jīng)分離鑒定了百余種芋螺毒素[2-5]。

芋螺毒素一般是含有7～46個(gè)氨基酸殘基的小肽，分子量小，富含二硫鍵，前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有多樣性，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的核酸編碼的動(dòng)物神經(jīng)毒素肽。芋螺毒素能選擇性地作用于離子通道等蛋白受體，進(jìn)而影響神經(jīng)傳導(dǎo)，產(chǎn)生不同的生理作用[6]。根據(jù)芋螺毒素基因及其前體蛋白信號(hào)肽的保守性，可將其分為A、O、T、M、P、I等多個(gè)超家族，在每個(gè)超家族中，再依據(jù)其對生物體作用靶位以及藥理活性的不同又可將其分為α、ω、μ、δ等不同的亞型。α、αA、κA屬于A-超家族，ω、δ、κ、μO屬于O-超家族，μ、φ、κM屬于M-超家族。

O-超家族芋螺毒素主要作用于電壓門控離子通道(又稱電壓敏感性通道)，包括Ca2+通道、Na+通道和K+通道等。作用于Ca2+通道的只有O-超家族的ω-芋螺毒素。由于ω-芋螺毒素具有高親和力、高度專一性的特點(diǎn)，能特異性地阻斷電壓敏感型Ca2+通道，在離子通道亞型鑒定、神經(jīng)疾病治療方面發(fā)揮重要作用，已成為神經(jīng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、多肽化學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6-12]。下面就其藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展以及合成方法兩方面進(jìn)行闡述。

1 ω-芋螺毒素的藥代動(dòng)力學(xué)研究

目前對ω-芋螺毒素的藥代動(dòng)力學(xué)研究主要集中于其已上市的合成等效物Ziconotide。Ziconotide是首個(gè)應(yīng)用于臨床的具有神經(jīng)元特異性的N-型電壓敏感性鈣通道阻斷劑，已分別獲得美國FDA和歐盟EC的上市許可。其作用機(jī)制是通過鞘內(nèi)輸注治療嚴(yán)重慢性疼痛，可緩解其他治療無效的疼痛，并且長時(shí)間應(yīng)用該藥不會(huì)產(chǎn)生成癮性及耐受性。

1.1 臨床前藥動(dòng)學(xué)研究 Bowersox等人[13]對Ziconotide 24 h持續(xù)、勻速靜脈輸注時(shí)在大鼠及獼猴體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行了研究。采用放免法對不同時(shí)間的血漿藥物濃度進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示兩種動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)很相近，且各項(xiàng)參數(shù)無劑量及性別依賴性；開始滴注后的2～4 h內(nèi)，到達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度(Css)，且所得數(shù)據(jù)符合二室模型；穩(wěn)態(tài)時(shí)的分布體積(Vd)約為體質(zhì)量的40%，表明藥物在血管內(nèi)外均有分布，血管外藥物分布于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的體液中；大鼠和獼猴的血漿蛋白結(jié)合率分別為56%和73%，且呈非特異性、非飽和性和低親和力，因此藥物不會(huì)在血管內(nèi)滯留。其清除過程由兩階段組成，消除曲線為雙指數(shù)曲線。大鼠和獼猴的表觀清除半衰期分別為4.61 h和6.48 h。大鼠在滴注開始1 h內(nèi)，高低劑量組分別約有93%和17%出現(xiàn)輕微震顫；獼猴在滴注開始0.5 h內(nèi)，所有高劑量組和50%低劑量組出現(xiàn)輕微震顫。

在Elan公司關(guān)于犬的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)告[14]中，單次鞘內(nèi)注射Ziconotide后，其在犬的腦脊液中快速分布，進(jìn)而迅速分布至脊髓及其他組織。持續(xù)鞘內(nèi)滴注Ziconotide后，在腦脊液中的藥物濃度與在血漿中的藥物濃度之比約為1 000∶1，表明其主要分布于作用靶點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中結(jié)合H3-inulin，結(jié)果顯示Ziconotide在腦脊液中的清除速度與腦脊液本身的總體流動(dòng)速度接近。

Staats等人[15]的研究表明，鞘內(nèi)注射的Ziconotide在血漿中消除迅速，因此導(dǎo)致相當(dāng)少的血漿蛋白結(jié)合。靜脈注射的Ziconotide于2～24 h即在大鼠的腦組織中降解，并且檢測不到所產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，其從腦脊液和循環(huán)系統(tǒng)中清除的速度也較快，表明Ziconotide在腦脊液中的分布和代謝也是迅速的。

Newcomb等人[16]研究了Ziconotide的腦內(nèi)生物利用度、血-腦通透性及其在腦細(xì)胞外液的擴(kuò)散、降解情況。靜脈注射Ziconotide后，約3～20 min，在大鼠腦內(nèi)的濃度達(dá)到最大值，每克組織中的藥物濃度約為0.003%～0.006%，2 h后降至每克組織中含0.001%。在海馬植入體內(nèi)使用透析探針灌注Ziconotide時(shí)，也有相似的結(jié)果。圖像分析和連續(xù)切片法均顯示在透析探針周圍細(xì)胞外液中Ziconotide的含量很少，2 h后其范圍也在1 mm以內(nèi)。

1.2 臨床藥動(dòng)學(xué)研究 健康男性志愿者靜脈持續(xù)滴注本品的血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)表明，該藥物符合線性消除的二房室開放性藥動(dòng)學(xué)模型。血漿穩(wěn)態(tài)濃度與滴注速率成比例。消除半衰期為1.3 h，t1/2約為5.3 h[17]。

Wermeling[14]和Staats等人[15]還研究了Ziconotide在腦脊液中的藥動(dòng)學(xué)(PK)，以及其在血漿和腦脊液中的濃度與安全性和有效性的關(guān)系(PK-PD關(guān)系)。鞘內(nèi)注射Ziconotide(1、5、7.5或10 μg·kg-1·d-1)于22名慢性非惡性疼痛患者后48 h內(nèi)，腦脊液中的藥物濃度曲線可能呈多房室特征；腦脊液中藥物半衰期為2.9～6.5 h(平均為4.5 h)，清除率為0.26 mL·min-1，分布容積為99.2 mL。劑量標(biāo)準(zhǔn)化AUC、Cmax，Cl，Vd和t1/2等均與劑量成比例，提示其在腦脊液的分布不隨劑量增加而出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。腦脊液的平均值和中間值分別是155 mL和99 mL，均與成人的腦脊液體積約(130±30)mL接近。腦脊液的AUC/D平均值是70.8 ng·h·mL-1·μg-1，t1/2是4.6 h，Cmax/D是15.0 ng·mL-1·μg-1。腦脊液與血漿中的藥物濃度比是303∶1 165。PK-PD有相關(guān)性。采用疼痛強(qiáng)度視覺模擬評(píng)分及疼痛緩解分類評(píng)分觀察到鎮(zhèn)痛效果與劑量相關(guān)，但大劑量在增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效果的同時(shí)也增加了神經(jīng)系統(tǒng)副作用發(fā)生的可能。4例病人給藥后出現(xiàn)低血壓。

Ziconotide在血漿和腦脊液中呈線性清除過程[17]，與其以1～10μg·kg-1·d-1靜脈滴注時(shí)血漿中的特征一致[18]。腦脊液Cl的平均值和中間值分別是0.38 mL·min-1和0.26 mL·min-1。成人腦脊液形成或消除的速度是0.35～0.37mL·min-1，即其在腦脊液中的清除速度與腦脊液本身的總體流動(dòng)或稱周轉(zhuǎn)率接近[15]，這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相吻合。

2 ω-芋螺毒素的合成

目前解決藥源問題主要有三種方法。

第一種是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法獲取量非常少，且近年來海洋生態(tài)的破壞使得野生芋螺數(shù)量急劇減少，該法會(huì)進(jìn)一步加劇芋螺資源惡化，因此靠分離提取獲得大量的ω-芋螺毒素用于研究和生產(chǎn)并不現(xiàn)實(shí)，但提取到的少量天然毒液可通過一系列儀器分析手段得到單個(gè)毒素肽的氨基酸序列，再根據(jù)所得序列人工合成這些肽，可進(jìn)一步用于活性測試和結(jié)構(gòu)分析。

第二種是基因工程方法，即將芋螺毒素的基因轉(zhuǎn)化到微生物中使其表達(dá)，后期再進(jìn)行分離純化[19]。由于部分ω-芋螺毒素的N端為Cys，酰胺化C端，加之原核表達(dá)系統(tǒng)無法加工去除N-端信號(hào)肽序列，無法解決酰胺化C端問題，且ω-芋螺毒素分子小，堿性氨基酸較多，難于形成特定活性構(gòu)象，使得分離純化較為困難。但隨著基因工程技術(shù)的日新月異，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信號(hào)肽，或同時(shí)轉(zhuǎn)入酰胺化酶基因，可望在不久的將來生產(chǎn)出大量廉價(jià)的重組芋螺毒素，這對芋螺毒素藥物研究和產(chǎn)業(yè)化將起到至關(guān)重要的作用。另一方面，芋螺毒素是基因直接表達(dá)的產(chǎn)物，現(xiàn)代基因工程技術(shù)也促進(jìn)了芋螺毒素的研究與開發(fā)。目前國內(nèi)外對芋螺毒素的研究已深入到了分子生物學(xué)領(lǐng)域，在研究芋螺毒素基因的結(jié)構(gòu)和生物合成過程，尋找新芋螺毒素基因，研究其分子遺傳學(xué)機(jī)制，蛋白質(zhì)折疊機(jī)制方面有重要的應(yīng)用，且已取得了較快的進(jìn)展。構(gòu)建芋螺毒素cDNA文庫，從中篩選新ω-芋螺毒素基因已成為研究新ω-芋螺毒素及其分子特征的重要途徑之一[20]。

第三種是采用人工化學(xué)合成的方法，即通過分離天然芋螺毒素后測序或采用基因克隆方式獲得芋螺毒素序列，然后采用人工化學(xué)合成獲得更多量的芋螺毒素，目前較多使用的是多肽固相合成法。與傳統(tǒng)的多肽液相合成法相比，該法具有如下優(yōu)越性：只需經(jīng)過過濾和沖洗，就可以將產(chǎn)物多肽從可溶性試劑中分離開來；易于使用自動(dòng)化設(shè)備；過量的反應(yīng)試劑促使反應(yīng)徹底進(jìn)行；反應(yīng)產(chǎn)物多肽一直結(jié)合在固相載體上，損失量將達(dá)到最小。根據(jù)氨基端保護(hù)基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法為Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少等特點(diǎn)，大多芋螺毒素的合成都采用該方法[21-24]。合成后將肽鏈從樹脂上裂解下來，常用的裂解劑為reagent K試劑(trifluoroacetic acid∶water∶ ethanedithiol∶ phenol∶thioanisole，90∶5∶ 2.5∶7.5∶5)。接著脫去側(cè)鏈保護(hù)基、復(fù)性、純化，即可得到與天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究[25-26]。但由于ω-芋螺毒素氨基酸殘基較多，一般都在25個(gè)以上，其人工合成的產(chǎn)率較小，純度也低，合成的肽還需氧化折疊才能形成正確的構(gòu)象。氧化折疊的方法有空 氣 氧 化 法 、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧 化 法 等 。Favreau等[27]在合成ω-CNVIIA時(shí)，對這幾種氧化折疊方法作了比較，發(fā)現(xiàn)gluthatione氧化法效果最好。隨后進(jìn)行純化，即可得到具有天然毒素活性且純度較高的多肽，最后利用NMR技術(shù)進(jìn)行構(gòu)象分析[28-29]。因此，人工合成ω-芋螺毒素的成本較高，還不能完全滿足作為藥物商業(yè)化生產(chǎn)的要求。但由于ω-芋螺毒素藥物的用量小，效果好，價(jià)值高，人工合成可部分滿足市場需求。

綜上所述，ω-芋螺毒素具有分子小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易化學(xué)合成等特點(diǎn)，是一個(gè)闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的微型模型。海洋中有豐富的芋螺資源，為人類提供了良好的資源信息庫。目前得到的ω-芋螺毒素大多來源于食魚芋螺，但食蟲芋螺和食螺芋螺當(dāng)中也存在豐富的ω-芋螺毒素。國外已對30多種芋螺進(jìn)行了研究，由于芋螺所處的地理環(huán)境不同，同一芋螺所產(chǎn)生的芋螺毒素可能會(huì)完全不同。國內(nèi)主要對幾種芋螺(淺紋芋螺、織錦芋螺和桶形芋螺)毒素基因和毒液成分進(jìn)行了研究，絕大多數(shù)海南產(chǎn)的芋螺毒素急待研究與開發(fā)。雖然ω-芋螺毒素研究已經(jīng)在生化、分子生物學(xué)、電生理和藥理等方面取得了重要進(jìn)展，但其深度和廣度還十分不夠，有待于進(jìn)一步研究，為芋螺資源的開發(fā)利用提供更多理論依據(jù)。

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